Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

1. Hücre kültürü, stres indüksiyonu ve örnekleme prosedürü NOT: Arka plan parçacıklarından kaçınmak için steril kültür cam takımları, pipet uçları ve 0,22 m’de filtrelenmiş büyüme ortamı kullanın. Burada, hücre kültürleri düşük otofloresan zengin tanımlanmış ortamda yetiştirilir (Malzeme Tablosubakınız )7,8. Bir Luria-Broth (LB) agarose plaka (gerekirse seçici antibiyotik ile) ve 37 ° C gecede (17 saat) inkübat üzerinde dondurulmuş gliserol stok ilgi bakteriyel zorlanma çizgi.NOT: Burada sunulan örnek deneyde Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry kullanabilirsiniz. Bu tür, HU nükleoid ilişkili proteinin floresan etiketli α alt birimini üreterek canlı hücrelerdeki kromozomun ışık mikroskobu görselleştirilmesine olanak sağlar9. Tek bir koloni ile orta 5 mL aşılamak ve 37 °C dakikada 140 dönüş (rpm) gecede (17 saat) sallayarak büyümek. Çalkalanan kültürün tatmin edici bir şekilde aeretilmesini sağlamak için şişeler (≥50 mL) veya büyük çaplı (≥2 cm) test tüpleri kullanılmalıdır. Ertesi sabah 600 nm (OD600nm)optik yoğunluğu ölçmek ve 0,01 bir OD600nm taze orta içeren bir test tüpü içine kültürü seyreltmek. Kültürün toplam hacmi, deney sırasında analiz edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Kültürün 200 μL’lik bir örneğini bir mikro plakaya (şeffaf bir alt kısımla çalışma hacminin kuyusu başına 0,2 mL) yükleyin ve 37 °C’de kuluçka sırasında OD600nm izleme için otomatik bir plaka okuyucusuna (Bkz. Malzeme Tablosunabakın). Aşılanmış test tüpünü 37 °C’de sallayarak (140 rpm) OD600nm = 0.2’ye inkütün, zengin ortamda tam üstel faza karşılık gelen.NOT: Uygun üstel büyüme elde etmeden önce en az 4−5 nesil boyunca hücreleri büyütmek çok önemlidir. Adım 1.3’te kullanılan ilk inokül (OD600nm = 0,01) daha yoksul ortamda büyüme durumunda (örneğin, üstel fazın OD 0.2’nin altına ulaştığı durumlarda) veya daha fazla nesil isteniyorsa (örn. belirli fizyolojik çalışmalar veya genişletilmiş stres tedavileri için) uyarlanmalıdır. OD600nm = 0.2’de, t0 zaman noktasına karşılık gelen aşağıdaki kültür örneklerini alın (stres indüksiyonundan önce katlanarak büyüyen hücreler): (1) Zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme için mikroakışkan cihaza hemen yüklenmek üzere 150 μL’lik bir numune (bkz. bölüm 2); (2) Seyreltme ve kaplama taslısı için 200 μL’lik bir numune (bkz. bölüm 3); (3) Akış sitometrisi analizi için buza konulacak 250 μL numune (bölüm 4); (4) Mikroskop anlık görüntüleme için agarose monte edilmiş bir slayta hemen 10 μL’lik bir numune yatırılmalıdır (bkz. bölüm 5). Test tüpünde kalan hücre kültürünü, 37 °C’de titreyerek (140 rpm) araştırmak ve kuluçkaya yatırmak istediğiniz özel stres tedavisine maruz bırakın.NOT: OD600nm izleme için otomatik plaka okuyucuda büyüyen kültür de stres tedavisine tabi tutulmalıdır. Stres tedavisinden sonra ilgili zaman noktalarında (t1, t2, t3, vb.), stresli kültürden aşağıdaki hücre örneklerini alın: (1) Seyreltme ve kaplama tsay için 200 μL numune (bkz. bölüm 2); (2) Akış sitometri analizi için buza konulması gereken 250 μL’lik bir numune (bölüm 3); (4) Mikroskopi enstantane görüntülemesi için agarose monte edilmiş bir slayta hemen 10 μL’lik bir numune yatırılmalıdır (bkz. bölüm 4).NOT: Her stresin neden olduğu tedavidoz ve zamana bağlı bir verime sahiptir. Bu nedenle, optimal sonuçlar için kullanılacak tedavinin dozu ve süresini belirlemek için ön testler inyapılması gerekebilir. Bu dozlar ve maruz kalma süreleri bir dizi ile tedavi bir hücre kültürünün otomatik bir plaka okuyucu (potansiyel kaplama tahlilleri ile ilişkili) kullanarak OD izleme gerçekleştirerek yapılabilir. Burada sunulan deneyde hücre kültürü hücre bölünmesi inhibe edici antibiyotik sefalikin (Ceph.) ile 5 μg/mL son konsantrasyonda 60 dk ile tedavi edildi. Cephalexin daha sonra santrifüj (475 g, 5 dk) kullanarak 15 mL’lik bir tüpteki hücreleri peletleyerek, süpernatantı çıkararak, hücre peletini nazik pipetleme ile eşit hacimde taze ortamda yeniden sulandırarak ve temiz bir tüpe aktararak yıkandı. Yıkanan hücreler 37 °C’de, iyileşmek için sallayarak (140 rpm) kuluçkaya yatırıldı. Örnek t60 (60 dk sonra sefaleksin ilavesi ‘sefaleksin-60min tedavi’ örneğine karşılık gelen, t120 (60 dk yıkadıktan sonra) ve t180 (yıkamadan sonra 120 dk) olarak alınmıştır. 2. Kaplama tsay NOT: Kaplama tonu, kültür örneklerinde CFU üretebilen hücrelerin konsantrasyonunu ölçmeye olanak sağlar. Bu işlem, bir hücrenin iki canlı hücreye bölünme hızını ortaya çıkarır ve hücre bölünmesi tutuklamalarını (örn. hücre lizisinin bakteri üretim süresinin artması) saptamaya olanak tanır. 200 μL’lik kültür numunesinin 10-7’sine kadar 10 kat seri seyreltmeleri taze ortamda hazırlayın. 37 °C’de gece kuluçkadan sonra 3−300 koloni arasında elde etmek için seçici olmayan LB agarose plakaları üzerinde uygun seyreltme plakası 100 μL.NOT: Bakteri bölünmelerini sınırlamak için taze ortamda seri seyreltme hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak, araştırmacılar seyreltme işlemi sırasında hücre bölünmelerini önlemek için bir karbon kaynağı olmadan tuzlu bir çözüm kullanarak düşünebilirsiniz. Ertesi gün, her kültür örneğinde canlı hücrelerin (CFU/mL) konsantrasyonunu belirlemek için kolonilerin sayısını sayın. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilen hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak CFU/mL’yi çizin. 3. Akış sitometrisi NOT: Aşağıdaki bölümde akış sitometri sitometrisi analizi için hücre örneklerinin hazırlanması açıklanmaktadır. Bu analiz tekniği çok sayıda hücre için hücre büyüklüğü ve DNA içeriğinin dağılımını ortaya koymaktadır. Mümkün olduğunda, akış sitometri örneklerinin hemen işlenmesi tavsiye edilir. Alternatif olarak, numuneler buzüzerinde tutulabilir (6 saate kadar) ve gün sonunda aynı anda analiz edilebilir, kaplama ve mikroskopi görüntüleme yapıldıktan sonra. 250 μL kültür örneğini seyreltin ve 4 °C’de taze ortamda ~15.000 hücre/μL konsantrasyonda (OD600nm ~0.06’ya karşılık gelen) 250 μL elde edin.NOT: Buz üzerinde kuluçka hücrelerin büyüme ve morfolojik modifikasyon usınırlar. Alternatif olarak, kullanıcı genellikle akış sitometri10için tavsiye edilir, % 75 etanol hücrelerin fiksasyon gerçekleştirmeyi düşünebilirsiniz. DNA boyama için, bakteri örneğini DNA floresan boyanın 10 μg/mL çözeltisi (oran 1:1) ile karıştırın ve numuneyi analiz etmeden önce karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın. ~ 120.000 hücre / dk akış hızı ile akış sitometre içine örnek geçirin. Uygun ayarlarla ileriye dağılmış (FSC) ve yan lara dağılmış (SSC) ışığın yanı sıra DNA floresan boya floresan floresan sinyali (FL-1) edinin. FSC ve FL-1 hücre yoğunluğu histogramlarını, hücre popülasyonundaki hücre büyüklüğü ve DNA içeriğinin dağılımını temsil edecek şekilde çizin. 4. Enstantane mikroskopi görüntüleme NOT: Aşağıdaki bölümde nüfus anlık analizi için mikroskopi slaytlarının hazırlanması ve görüntü edinimi açıklanmaktadır. Bu prosedür, hücrelerin morfolojisi (hücre uzunluğu, genişliği, şekli) ve nükleoid DNA’nın hücre içi organizasyonu ile ilgili bilgi sağlayacaktır. Gözlemlere başlamadan önce sıcaklığı dengelemek için termosesmikroskop haznesini 37 °C’de önceden ısıtın. Bu oda, zaman atlamalı deneyler sırasında mikroskop optiklerinin ve numune aşamasının sıcaklık modülasyonuna izin verir. Lesterlin ve Dubarry7’deaçıklandığı gibi agarose monte edilmiş slaytları hazırlayın. Plastik filmi mavi çerçevenin altından çıkarın (Bkz. Malzemeler Tablosu),diğer tarafta içi boş plastik film bırakarak. Mavi çerçeveyi mikroskop cam slaytına yapıştırın. Pipet ~150 μL eritilmiş % 1 agarose orta çözelti ve mavi çerçeve bölmesi içinde dökün. Hızla aşırı sıvı kaldırmak için temiz bir coverslip ile kapak ve oda sıcaklığında katılaşmak için agarose ped için birkaç dakika bekleyin. Hücre örneği hazır olduğunda, kapak kayslipini ve plastik filmi mavi çerçeveden çıkarın. Agarose pedüzerine 10 μL’lik hücre örneğini dökün ve damlacığı yaymak için cam kaydırağı hafifçe yatırın. Tüm sıvı adsorbe edildiğinde, numuneyi mühürlemek için mavi çerçeveye temiz bir kapak kaydırın. Mikroskopi slaytı artık mikroskopi için hazır. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve iletilen ışığı kullanarak (faz kontrastı hedefiyle) ve ışık kaynağı uyarma ile uygun dalga boylarında (mCherry için 560 nm) görüntü edinimi gerçekleştirin. Görüntü analizi sırasında otomatik hücre algılamasını kolaylaştırmak için yalıtılmış hücreler içeren görünüm alanlarını seçin. Hücre popülasyonunun sağlam istatistiksel analizine olanak sağlamak için en az 300 hücrenin görüntülendirilediğinden emin olun. 5. Mikroakışkanlar zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme NOT: Aşağıdaki bölümde mikroakışkan plakaların hazırlanması (Bkz. Malzeme Tablosu),hücre yüklemesi, mikroakışkanprogramı ve zaman atlamalı görüntü edinimi açıklanmaktadır. Bu görüntüleme prosedürü gerçek zamanlı olarak tek tek hücrelerin davranışını ortaya koymaktadır. Koruma çözeltisini mikroakışkan plakadan çıkarın ve mikroakışkan yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi önceden ısıtılmış 37 °C’ye kadar taze orta ile değiştirin. Mikroakışkan plakayı manifold sistemine kapatın ve Priming düğmesine tıklayın. Mikroakışkan plakayı manifold sistemi yle mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroskobu edinmeye başlamadan önce 37 °C’de ~2 saat önceden ısıtın.NOT: Bu ön ısıtma adımı mikroakışkan haznenin genişlemesini önlemek için önemlidir, bu da zaman atlamalı deney sırasında mikroskobun odaklaşmasını ve görüntü ediniminin tehlikeye atılmasını değiştirir. Mikroakışkan plakayı kapatın. Ortayı kuyu 8’den 150 μL kültür örneği ile değiştirin ve ortayı 1’den 5’e kadar istediğiniz ortamla veya strese neden edici reaktifolmadan değiştirin. Mikroakışkan plakayı kapatın ve mikroskop aşamasına yerleştirin. Mikroakışkan yazılımda (bkz. Malzemeler Tablosu)hücre yükleme işlemini çalıştırın. Aktarılan ışıkta mikroskop altına bakarak hücrelerin yüklenmesinin tatmin edici olup olmadığını kontrol edin. Bölmedeki hücre yoğunluğu yetersizse hücre yükleme işlemini ikinci kez çalıştırın. İletilen ışık modunda dikkatlice odaklanın ve izole edilmiş bakterileri gösteren çeşitli görüş alanlarını seçin. Zaman içinde yalıtılmış hücrelerin büyümesini izleyebilmek için aşırı kalabalık olmayan alanları seçmek önemlidir (~100 μm2’de ~10−20 hücre önerilir). Bu da görüntü analizi sırasında hücre algılama kolaylaştıracaktır. Mikroakışkan yazılımda Protokol Oluştur düğmesine tıklayın. Hücrelerin uyum sağlaması için 1−2 nesil zaman eşdeğerleri için büyüme ortamının enjeksiyonu program (isteğe bağlı). Daha sonra 2 psi 10 dakika boyunca stres indükleyen orta enjeksiyon programı, stres tedavisi nin istenen süre için 1 psi enjeksiyon ardından. Eğer stres ten sonra hücrelerin iyileşme analiz etmek niyetinde, program taze büyüme orta istenen süre için enjeksiyon.NOT: Burada sunulan deneyde sefaleksin 2 psi’de 10 dakika, ardından 1 psi’de 50 dk enjekte edildi. Daha sonra, taze büyüme ortamı 10 dakika için 2 psi enjekte edildi, 1 psi 3 saat izledi. İletilen ışıkta faz kontrastı ve gerekirse mCherry sinyali için 560 nm uyarma ışık kaynağı kullanarak her 10 dakikada bir 1 kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme yapın.NOT: Mikroskobik enjeksiyon protokolünün başlamasıyla aynı anda mikroskobik görüntü edinimi nin başlatılması önemlidir. 6. Görüntü analizi NOT: Bu bölümde, anlık görüntü ve hızlandırılmış mikroskopi görüntülerinin işlenmesi ve analiz edilmesinin temel adımları kısaca açıklanmaktadır. Mikroskopi görüntülerinin açılması ve görüntülenmesi açık kaynak ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11ile yapılır. Kantitatif görüntü analizi ücretsiz MicrobeJ eklentisi12 (https://microbej.com) ile birlikte açık kaynak ImageJ / Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol MicrobeJ 5.13I sürümünü kullanır. Fiji yazılımını ve MicrobeJ eklentisini açın. Anlık görüntü analizi için, görüntüleri bir araya getirmek ve elde edilen görüntü yığınları dosyasını kaydetmek için bir mikroskop slaytına (bir örnek) karşılık gelen tüm görüntüleri MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakın. Hızlandırılmış veriler için görüntü yığınını MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakmanın. Hücre anahatlarının faz kontrast ı görüntüsünün ve ilgiliyse nükleoidlerin lekeli DNA floresan sinyalinin segmentasyonuna dayalı olarak otomatik olarak algılanmasını çalıştırın. Hücre algılamanın doğruluğunu görsel olarak kontrol edin ve gerekirse düzeltme için MicrobeJ düzenleme aracını kullanın. Elde edilen sonuç dosyasını kaydedin.NOT: E. coli hücrelerinin tespiti için kullanılan ayarlar Malzeme Tablosu’nda belirtilmiştir (bkz. MicrobeJ’in Yorumlar/Açıklama sütunu). Diğer bakteri türleri için (özellikle çubuk şeklinde olmayan bakteriler için), kullanıcı algılamadan önce ayarları hassaslaştırmalıdır (Bkz. MicrobeJ öğretici). Hızlandırılmış görüntüler için, microbeJ düzenleme aracını kullanarak hücrelerin yarı otomatik olarak algılanması, tek tek hücrelerin kaderine odaklanılmasıiçin tercih edilebilir (bkz. Analizi tamamlamak ve ResultJ penceresini elde etmek için ResultJ simgesine tıklayın. Bu noktadan birçok farklı türde çıktı grafiği oluşturulabilir. Hücre şekli/uzunluğu ve hücre başına ortalama nükleoid sayısının normalleştirilmiş histogramlarını çizin.