Summary

細菌性ウィルト病の簡単な遺伝子解析のためのラストニア・ソラナセアラムによるトマト根形質転換

Published: March 11, 2020
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Summary

ここでは、細菌性萎痛病の研究のための簡単な遺伝子解析を行うために、ラストニア・ソラナ科を接種した後、トマト根形質転換のための汎用性の高い方法を提示する。

Abstract

ラルストニア・ソラナ科は、広範囲の植物種に感染し、農業に対する重要な脅威を引き起こす壊滅的な土壌媒介血管病原体です。しかし、ラストニアモデルは、シロイヌナプシスシュードモナスシリンゲのような細菌性植物病原体を含む他のモデルと比較してかなり未踏である。ラルストニアと作物植物の相互作用を理解することを目的とした研究は、細菌性萎し病と戦うために持続可能な解決策を開発するために不可欠であるが、現在、ネイティブホスト植物における相互作用の異なる成分を特徴付ける簡単な実験的アッセイの欠如によって妨げられている。このシナリオでは、我々は、トマトのラルストニア感染の遺伝子解析を行う方法を開発しました,ラルストニアの自然なホスト.この方法は、トマト根のアグロバクテリウム・リゾゲレンス-媒介性変換に基づいており、続いて得られた植物の土壌びしょ濡れの接種を行い、目的の構築物を発現する形質転換された根を含む。根形変換アッセイの汎用性により、RNAiによって媒介される遺伝子過剰発現または遺伝子サイレンシングのいずれかを行うことができます。概念実証として、この方法を用い、RNAi媒介性のトマト根におけるSlCESA6のサイレンシングがラルストニアに対する耐性を与えることを示した。ここでは、この方法を詳細に説明し、比較的短時間で、機器や植物の成長空間の要件が小さい細菌性萎し病を理解するための遺伝的アプローチを可能にする。

Introduction

細菌性萎痛病の原因物質であるラルストニア・ソラナ科は、ジャガイモ、トマト、タバコ、バナナ、コショウ、ナスなど、植物種の広い範囲に感染する可能性のある世界的な分布を有する壊滅的な土壌媒介血管病原体1,である。ラルストニアによって引き起こされる収量損失は、品種、気候、土壌および他の要因に応じて、トマト、ジャガイモまたはバナナの生産の80-90%に達することができます3.しかし、ラルストニアモデルは、シュードモナスシリンガエキサントモナス属などの細菌性植物病原体を含む他のモデルと比較してかなり未踏である。さらに、植物と微生物の相互作用のほとんどの研究は、モデル植物シロイヌナズナ科に焦点を当てています。これらのモデルを用いた研究は、植物と細菌の相互作用の理解に大きく貢献していますが、作物植物におけるこれらの相互作用を理解する現在の必要性には対処していません。ラルストニアと作物植物の相互作用を理解することを目的とした研究は、細菌性萎し病と戦うために持続可能な解決策を開発するために不可欠であるが、現在、相互作用の異なる構成要素を特徴付けるための簡単な実験アッセイの欠如によって妨げられている。特に、ラルストニアの天然宿主であるトマトは、世界で2番目に重要な植物作物であり、細菌性萎し症を含む多くの疾患4の影響を受ける。本研究では、トマトのラルストニア感染の遺伝子解析を行う簡素な方法を開発した。この方法は、トマト根のアグロバクテリウム-媒介性形質転換に基づいており、DsRed蛍光を選択マーカー5として使用し、続いて得られた植物のラルストニア土壌びしょ濡れの接種を行い、目的の構築物を発現する形質転換された根を含む。根形変換アッセイの汎用性により、RNAiによって媒介される遺伝子過剰発現または遺伝子サイレンシングのいずれかを行うことができます。

この方法の潜在的な制限は、非変換された根の残留成長に基づいて行われます。これは、使用されるプラスミドが変換された根の選択を可能にするレポーター遺伝子を欠いている場合に特に重要である。この問題を解決するために、我々は、健康な抗生物質耐性形質転換根の成長を可能にしながら、非形質化された根の成長を阻害する抗生物質選択に基づく代替方法を開発した。A.根生は芽の変態を誘発しないので、抗生物質の影響を受けやすく、したがって、抗生物質含有培地から分離しておくべきである。

ラルストニアに対する植物耐性はよく理解されていないが、いくつかの報告は、細菌のしおれ,6、7、8、97に対する耐性の強化に関連する細胞壁の変化を有する。8,96これらの細胞壁の変化が血管の発達に影響を及ぼすことが示唆されている、 植物10内のラルストニアの生活様式に不可欠な側面。シロイヌナズナのセルロース合成酵素CESA4、CESA7およびCESA8をコードする遺伝子の突然変異は、二次細胞壁の完全性を損なうことを示しており、これはABAシグナル伝達8に関連していると思われるラルストニアに対する耐性の増強を引き起こす。 CESA4そこで、我々の方法の概念実証として、SlCESA6(Solyc02g072240)、Solyc02g072240セルロース合成酵素の二次細胞壁セルロースシンターゼ、およびAtCESA8のオルソログ(At4g18780)のRNAi媒介遺伝子サイレンシングを行った。 SlCESA6その後のラルストニアによる土壌びしょ濡れの接種は、SlCESA6をサイレンシングする細菌性萎し症状に対する耐性が高まることを示し、ラルストニアに対する細胞壁媒介性耐性がトマト中で保存される可能性が高いことを示唆し、トマト根における細菌性萎し耐性の遺伝子解析を行う方法を検証した。ここでは、この方法を詳細に説明し、比較的短時間で、機器や植物の成長空間の要件が小さい細菌性萎し病を理解するための遺伝的アプローチを可能にする。

Protocol

注:この方法の重要な部分は、インビトロで植物材料を取り扱うことを含むので、DsRed蛍光の可視化を含むすべてのこれらの手順の間に無菌状態を維持することが重要です。すべての変換プロセス中に、トマトの苗は25-28 °Cおよび16時間/8時間のライト/ダーク(130 μmol光子m-2s-1光)で成長する。プレートは、ガス交換および蒸散を容易にするためにマイクロポアテー?…

Representative Results

図5は、空のベクター(EV)で形質転換した根を有するトマト植物の疾患症状の発達を示し、そして、RNAi構築物を標的とする根を有する植物はSlCESA6(Solyc02g072240)を標的とする。 SlCESA6 Solyc02g072240疾患指標データ(図5A)は、0から4までの任意のスケールに従って、同じ実験単位(各植物)から時間の経過とと?…

Discussion

ラルストニア・ソラナ科は農業に対して重要な脅威を与えている。しかし、農業の重要性の自然の宿主との相互作用は、特に作物植物種において、他の細菌病原体と比較してまだ十分に理解されていない。ほとんどの場合、遺伝的解析は、宿主植物を遺伝的に改変するために必要な時間と費用によって妨げられる。この問題に対処し、トマトにおけるR.ソラナ科の感染の遺伝子?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

マッチョ研究所の研究室メンバーの皆さんに、有益な議論、統計アドバイスのためのアルバロ・ロペス・ガルシア、そしてこの作業中の技術的および管理的支援のための新宇建に感謝します。我々は、蛍光イメージングの支援のためのPSC細胞生物学のコア施設に感謝この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(助成金XDB27040204)、上海植物ストレス生物学センター(中国語)科学アカデミー)と中国の1000タレントプログラム。

Materials

90 mm square Petri-dishes
Agar powder Sigma-Aldrich
Bacto peptone BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 Berthold Technologies
Jiffy pots Jiffy Products International A.S.
Micropore tape 3M
Murashige and Skoog medium (M519) Phytotechlab
Pindstrup substrate Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract OXOID

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Morcillo, R. J. L., Zhao, A., Tamayo-Navarrete, M. I., García-Garrido, J. M., Macho, A. P. Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease. J. Vis. Exp. (157), e60302, doi:10.3791/60302 (2020).

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