Summary

生体試料中のキチナセ活性の測定

Published: August 22, 2019
doi:

Summary

ここでは、気管支肺胞洗浄剤や血清などの生体液中のキチナーゼ活性を測定する簡単な方法を示す。

Abstract

チチナセは、チチンをクアッヒする酵素です。チチンが存在しない場合でも、哺乳類はベースラインを含む体内に大量のチチナラが存在する。キチナゼの正確な役割は知られていないが、キチン含有食品および病原体に対する消化および宿主防御において重要な役割を果たすと考えられていた。私たちをはじめとする最近の研究は、宿主免疫およびアレルギー疾患におけるチチナゼおよびチチラーゼ様タンパク質の重要な役割を示している。重要なことに、キチナゼ活性は、喘息や肺線維症などの2型炎症性疾患を含む広範囲の疾患における疾患重症度の重要なバイオマーカーとして機能する。同様に、ガウチャー病のような遺伝性疾患を有する患者は、病気の重症度と相関するだけでなく、治療効果のための信頼性の高いバイオマーカーとしても機能するチチラーゼレベルを有意に上昇させました。ここで概説するプロトコルは、マウスのBALまたは血清サンプルにおけるチチラーゼ活性を測定する簡単で迅速かつ簡単な方法を説明し、酵素の高度に保存された性質のためにヒト被験者および他のモデル生物に広く適応することができる。

Introduction

キチンは、セルロースに次いで地球上で2番目に豊富な多糖類で、昆虫、真菌、酵母、藻類の外骨格を含む様々な生物の主要な構造成分として機能します。一部の脊椎動物はまた、チチン1を持っています.チチナセは、チチンを分解することができる酵素のファミリーであり、細菌から哺乳類2、3に至るまで種の進化を通じて高度に保存されています。哺乳類は、チチナーゼに加えて、チチナーゼに似たチチナーゼ様タンパク質を持ち、チチナーゼを結合する能力はありますが、チチン4を包丁する酵素能力が欠如しているという点で異なります。

1900年代初頭にさかのぼる調査で、チチンとチチナセは長い間研究されてきましたが、主な焦点は昆虫や他の無脊椎動物における役割に焦点を当ててきました。実際、脊椎動物がチチナラを全く持つことが判明したのは1960年代になってからでした。キトビアスベースのアッセイを用いて、トカゲやブラックバードを含む多数の脊椎動物の消化管にキチナセが見つかることを示した。.

哺乳類は、酸性哺乳動物キチチナゼ(AMCase;CHIT2およびCHIAとも呼ばれる)とキトトリオシダーゼ(CHIT1)4の2つの酵素活性形態を有する。これらのタンパク質の両方が加水分解チチンが可能である。しかし、CHIT1はヒトにおいてより酵素的に活性であり、そこではほとんどすべてのチチナゼ活性がCHIT1に由来する。4マウスにおいて、Chit1およびAMCaseの両方が、全体的なチチナゼ活性6にほぼ等しく寄与する。一方、チチナゼ様タンパク質はチチナゼ活性を欠いている。

Chit1は主にマクロファージによって分泌され、しばしばチチン含有病原体7に対する免疫応答であると考えられている。この酵素はまた、基板キチン8の存在がなくても、M1およびM2マクロファージサブタイプの両方に単球の成熟に関与することが示されている。さらに、Tヘルパー2(Th2)細胞および好酸球を含む他の免疫細胞の成熟に関与し得る-クリプトコッカス肺感染症9の場合に示された。これらの研究は、免疫系におけるチチナセの複雑な役割を指摘している。

近年、Chit1レベルは、リソソーム貯蔵疾患、感染症、呼吸器疾患、内分泌疾患、心血管を含む40種類以上のヒト疾患の進行の重要なバイオマーカーとして機能することが見出されている。疾患、神経疾患、およびその他(レビュー10)。これらの疾患の多くにおいて、Chit1のレベルは、疾患の重症度および治療効果10の強力な予測変数である。

チチナゼは、ガウチャー病を含む多数の病状のバイオマーカーとしての評判を得ているように、ツールやアッセイは、チチラーゼの存在のためのテストを容易にするために開発されています。古い方法には、Schalesの手順、血糖試験から適応されたプロトコル、および3,5ジトロサルチル酸(DNS)法が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、時間に敏感で技術的に困難です 11.これらの試験の両方の手順は、無機酸化剤の減少を必要とし、例えばシェールの手順の場合にはフェリシアニドは、分光光量測定のみ測定することができる色の変化を生み出す。さらに、両方のテストは、時間がかかり、色が12、13を開発するために必要な加熱または沸騰ステップを伴います。

ここで説明する哺乳動物試料14,15におけるキチナゼレベルを決定するための迅速かつ簡単なフッ素測定アッセイである。ここで使用されるサンプルの2つは血清および気管支胞洗浄液(BAL)を含む;キチターゼ活性は母乳および尿試料でも測定されており、その技術は、これらのタイプのサンプルおよび他の生物学的流体16、17において行うことができる。

Protocol

すべての動物の手順は、イェール大学医学部でIACUC承認プロトコルの下で行われました. 1. マウスサンプルコレクション 麻酔 ケタミンとキシラジンを使用してマウスを麻酔する (ケタミンの 100 mg/kg とキシラジンの 10 mg/kg). 血液サンプル収集 つま先のピンチに対する非応答性によって麻酔の深さを確認す?…

Representative Results

ここで示す結果は、ドキシサイクリンプロモーター上でChit1遺伝子を過剰発現する野生型(C57BL/6)およびChit1トランスジェニックマウス(C57BL/6バックグラウンド上)の血清およびBALサンプルにおけるキチネーゼ活性を測定した研究から得られたものである。我々のデータは、血清およびBALサンプルの両方がベースライン698.2±189.9 nmol/mL·hおよび485.7 ±114 nmol/ml·hで検出可能なキチナーゼ活性を有する…

Discussion

チチナゼ活性は、疾患の重症度、疾患の進行、治療効果および特定病原体存在を予測するための重要なバイオマーカーとして出現している18。チチラーゼの役割に関する長い仮定理論の多くは実験的に証明されていないが、新しい研究は、様々な疾患におけるタンパク質のようなチチナゼとチチナゼの役割に重要な洞察を提供している2、</su…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国肺協会と米国胸部学会賞のLSに対する支援を受けました。著者は、トランスジェニックマウス株を提供してくれたジャック・イライアス博士とチュン・ジュン・リー博士に心から感謝したいと思います。

Materials

4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

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Diesen Artikel zitieren
Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

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