Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

As proteínas envolvidas no tráfico de metabólitos constituem um nível essencial de regulação fisiológica, mas a grande maioria dos transportadores de membranas vegetais ainda não foi funcionalmente caracterizada. Várias estratégias foram implementadas para caracterizar novas proteínas de transporte. Expressão heterologous em organismos modelo como E. coli e células eucarióticas, como levedura, oócitos xenopus, células de mamíferos, células de insetos e células vegetais têm sido usados para determinar sua atividade de transporte¹. As células eucarióticas são favorecidas pela expressão de proteínas eucarióticas, pois a composição celular básica, as vias de transdução de sinal, transcrição e máquinas de tradução são compatíveis com as condições nativas.

O fermento tem sido um organismo modelo importante para a caracterização de novas proteínas de transporte em plantas. A primeira proteína de transporte vegetal que foi expressa com sucesso em levedura(Saccharomyces pombe)foi o transportador hexose HUP1 de Chlorella². Desde então, muitas proteínas de transporte de plantas têm sido funcionalmente caracterizadas usando um sistema de expressão de levedura. Estes incluem, transportadores de açúcar de plantas (SUC1 e SUC2^3,VfSUT1 e VfSTP1⁴⁾e os transportadores de auxina (AUX1 e PIN^5). As desvantagens de utilizar levedura para expressar proteínas vegetais podem incluir atividade prejudicada de proteínas localizadas com plastide, pois o fermento não tem essa organela, a segmentação inativa^6,e a formação de agregados mal dobrados e a ativação de respostas ao estresse em levedura devido à superexpressão das proteínas da membrana^7,8,9.

A expressão heterologous de proteínas do transporte em oocytes de Xenopus foi amplamente utilizada para a caracterização electrophysiological dos transportadores^10. As primeiras proteínas de transporte de plantas caracterizadas usando expressão heterologous em oócitos Xenopus foram o canal Arabidopsis potassium KAT1¹⁰ e o transportador de hexose Arabidopsis STP1¹¹. Desde então, os oócitos Xenopus têm sido empregados para caracterizar muitas proteínas de transporte de plantas, como transportadores de membrana plasmática^12,transporte de surose vacuolar SUT4¹³ e transportador de malado vacuolar ALMT9¹⁴. Uma importante limitação dos oócitos Xenopus para ensaios de transporte é que a concentração de metabólitos intracelulares não pode ser manipulada¹. Além disso, o conhecimento profissional é necessário para preparar os oócitos Xenopus e a variabilidade dos lotes de oócito é difícil de controlar.

A expressão heterologous no organismo modelo E. coli é um sistema ideal nos termos da caracterização de proteínas novas do transporte da planta. Com um genoma totalmente sequenciado^15,as características moleculares e fisiológicas de E. coli são bem conhecidas. Ferramentas e técnicas moleculares estão bem estabelecidas¹⁶. Além disso, vetores de expressão diferentes, cepas não patogênicas e mutantes estão disponíveis^17,18,19. Além disso, E. coli tem uma alta taxa de crescimento e pode ser facilmente cultivada em condições de laboratório. Muitas proteínas podem ser facilmente expressas e purificadas em quantidades elevadas em E. coli⁹. Quando as proteínas não podem ser amenizadas diretamente nos sistemas celulares, a reconstituição de proteínas em lipossomos também tem sido uma inovação bem sucedida, embora desafiadora, para a caracterização de proteínas de membrana purificadas. Caracterização funcional das proteínas de transporte mitocondrial de plantas, incluindo transportadores solute, como transportadores de fosfato em soja, milho, arroz e arabidopsia, portador de dicarboxil-tricarboxilato em Arabidopsis foram realizadas usando este sistema modelo^20,21. No entanto, proteínas recombinantes da proteína de tomate SICAT9 foram encontradas não funcionais em experimentos de reconstituição, e outros membros da família cat transportador foram encontrados para ser não funcional em xenopus oocyte ensaios²². Assim, são necessárias ferramentas moleculares adicionais para a caracterização dos transportadores de membrana.

Cinco sistemas de transporte de poliamina são encontrados em E. coli²³. Eles incluem dois transportadores ABC mediando a captação de espermidina e putrescine, um trocador putrescine/ornithine, um trocador de cadaverina/lysine, um exportador de espermidina e um importador putrescine. O trocador de putrescine PotE foi originalmente caracterizado usando um ensaio vesícula, onde de dentro para fora vesículas foram preparadas por células de lise com uma imprensa francesa e medindo a captação de putrescina radiografada nas vesículas em troca de orníntes²⁴. Os ensaios da vesícula também foram usados para caracterizar um transportador de cálcio, que mediava o transporte de cálcio em resposta a um gradiente de prótons²⁵. Esses experimentos nos levaram a desenvolver uma estratégia para a caracterização de outros trocadores de poliamina. Primeiro criamos uma cepa de e. coli deficiente em trocadores de PotE e CadB. Aqui, demonstramos a caracterização funcional de um antiporter de poliamina vegetal por expressão heterlogous na cepa e. coli modificada, geração de vesículas de membrana usando uma imprensa francesa e ensaios radiografados.