大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

代謝産物の密売に関与するタンパク質は、生理学的調節の本質的なレベルを構成するが、植物膜トランスポーターの大半はまだ機能的に特徴付けされていない。新規輸送タンパク質を特徴付けるために、いくつかの戦略が実施されている。酵母、ゼノプス卵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞などの大腸菌および真核細胞などのモデル生物における異種発現は、いずれもその輸送活性^を決定するために使用されている1。真核細胞は真核生物タンパク質の発現に好まれ、基本的な細胞組成、シグナル伝達経路、転写および翻訳機械は、天然の条件と互換性があるからである。

酵母は、植物における新規輸送タンパク質の特性評価のための重要なモデル生物となっています。酵母(サッカロミセスポンベ)で正常に発現した最初の植物輸送タンパク質は、クロレラ²からヘキ酸トランスポーターHUP1であった。それ以来、多くの植物輸送タンパク質は、酵母発現系を用いて機能的に特徴付けられてきた。これらには、植物糖トランスポーター(SUC1およびSUC23、VfSUT1およびVfSTP1⁴⁾およびオーキシントランスポーター(AUX1およびPIN⁵⁾が含まれる。植物タンパク質を発現するために酵母を利用する欠点は、酵母がこのオルガネラを欠いているため、プラスチド局在タンパク質の活性障害^、6を誤って標的化し、膜タンパク質の過剰発現^による酵母における誤折凝集体およびストレス応答の活性化を含^{むことができる。}

ゼノプス卵母細胞における輸送タンパク質の異種発現は、トランスポーター¹⁰の電気生理学的特性評価のために広く使用されている。ゼノプス卵母細胞における異種発現を用いて特徴づけられた最初の植物輸送タンパク質は、アラビドプシスカリウムチャネル^KAT111およびアラビドプシスヘキソプシストランスポーターSTP1¹¹であった。それ以来、ゼノプス卵母細胞は、血漿膜トランスポーター^12、空胞スクローストランスポーターSUT4¹³および空胞軟質泌トランスポーターALMT9¹⁴などの多くの植物輸送タンパク質を特徴付けるために採用されている。輸送アッセイのためのゼノプス卵母細胞の重要な制限は、細胞内代謝産物の濃度が^{操作できないということです 1.}さらに、ゼノプス卵母細胞を調製するために専門的な知識が必要であり、卵母細胞バッチの変動性を制御することは困難である。

モデル生物大腸菌における異種発現は、新規植物輸送タンパク質の特性評価の点で理想的なシステムである。完全に配列されたゲノム¹⁵では、大腸菌の分子的および生理学的特徴がよく知られている。分子ツールと技術は十分に確立されています¹⁶.加えて、異なる発現ベクター、非病原性株および変異体は^{、17、18、19}で利用可能である。さらに、大腸菌は高い成長率を有し、実験室条件下で容易に成長することができる。多くのタンパク質は、大腸菌⁹において高量で容易に発現および精製することができる。タンパク質を細胞系で直接アッセイできない場合、タンパク質をリポソームに再構成することも成功していますが、精製膜タンパク質の特性評価に関する革新は困難です。植物ミトコンドリア輸送タンパク質の機能特性評価は、大豆中のリン酸トランスポーターなどの溶質トランスポーターを含む、トウモロコシ、米およびアラビドプシス、ジカルボン酸トリカルボン酸キャリアをアラビドプシス中で、このモデルシステム^20、21を用いて達成されている。しかしながら、トマトタンパク質SICAT9の組換えタンパク質は再構成実験において機能的でないことが判明し、CATトランスポーターファミリーの他のメンバーはゼノプス卵母細胞アッセイ²²において機能的でないことが判明した。したがって、膜トランスポーターの特性評価には追加の分子ツールが必要です。

5つのポリアミン輸送システムが大腸菌²³に見られる。彼らは、スペルミジンとプトレシンの取り込みを仲介する2つのABCトランスポーター、プトレシン/オルニチン交換器、カダベリン/リジン交換器、スペルピジン輸出業者とプトレシン輸入業者が含まれます。プトレシン交換器PotEはもともと小胞アッセイを使用して特徴付けられていたが、そこではフランスのプレスで細胞をライジングし、オルニチン²⁴と引き換えに放射性標識プトレシンの取り込みを測定することによって小胞を調製した。小胞アッセイはまた、プロトン勾配²⁵に応答してカルシウムの輸送を媒介するカルシウムトランスポーターを特徴付けるために使用された。これらの実験は、他のポリアミン交換器の特性評価のための戦略を開発することを促しました。私たちはまず、PotEとCadB交換器で大腸菌欠乏株を作成しました。ここでは、修飾大腸菌株における異種発現による植物ポリアミン抗ポーターの機能的特徴、フランス語プレスを用いた膜小胞の生成、放射線標識アッセイを示す。