Summary

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

Published: December 20, 2019
doi:

Summary

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

Abstract

טאו הוא חלבון קשירה מיקרוטודורית המתבטאת הנוירונים הפונקציה הידועה העיקרית שלה קשורה לתחזוקה של יציבות ציטושלד. עם זאת, הראיות האחרונות הראו כי טאו נמצא גם בתאי subcellular אחרים כולל הגרעין שבו הוא מעורב הגנת ה-DNA, בתמלול rRNA, בניידות של retrotransposons ובארגון המבני של גרעינון. לאחרונה הוכיחו כי טאו גרעיני מעורב בביטוי של הגן VGluT1, מציע מנגנון מולקולרי שיכול להסביר את הגידול הפתולוגי של שחרור גלוטמט בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר. עד לאחרונה, מעורבות של הטאו הגרעיני ב מודולים את הביטוי של גנים היעד היה בטוח יחסית מעורפל בשל מגבלות טכניות שמנע את הדרה של תרומת cytoplasmic טאו או את ההשפעה של אחרים גורמים במורד הזרם. לא קשורים לטאו גרעיני כדי להתגבר על חוסר ודאות זה, פיתחנו שיטה ללמוד את הביטוי של גנים היעד במיוחד מאופנן על ידי חלבון הטאו הגרעיני. העסקנו בפרוטוקול שזוגות את השימוש באותות הלוקליזציה ובשבר הסלולר, דבר המאפשר להתיר את ההפרעה ממולקולות הטאו של הציטוטופלמיק. בעיקר, הפרוטוקול הוא קל והוא מורכב משיטות קלאסיות ואמינות החלות באופן כללי על מנת ללמוד את התפקוד הגרעיני של הטאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים סלולריים.

Introduction

הפונקציות של החלבון טאו בגרעין צברה עניין משמעותי בשנים האחרונות, כפי שהוא הוכח להיות קשור הדוק עם חומצות גרעין1,2,3,4,5,6. אכן, הגנום לאחרונה מחקר רחב הראה כי טאו נקשר רצפי DNA הגניים הבין vivo7. תפקיד בארגון נוקלאוולאר הוצע8,9,10,11. יתר על כן, טאו הציע להיות מעורב הגנת דנ א מ חמצוני היפרתרמיה5,10,12,13, ואילו מוטציה טאו היה קשור לחוסר יציבות כרומוזום ו מאנולודיה14,15,16.

עד היום, האתגרים בלימוד התפקודים של הטאו בתוך התא הגרעיני נותרו כמעט בלתי פתורים בשל הקשיים בניתוח התרומה הספציפית של הטאו הגרעיני מתרומתה של cytoplasmic טאו. יתרה מזאת, הפונקציות המיוחסות למולקולות של הטאו בתוך התא הגרעיני, עד כה, הן רק משום שהן חסרות הדגמה חד משמעית של המעורבות הישירה של החלבונים הגרעיניים של הטאו. ואכן, מעורבות של הטאו בניידות של הרטרוטרנספסונים או בתמלול או ב-DNA הגנה11,12,17,18,19 יכול להיות גם הסביר על ידי תרומת cytoplasmic טאו או על ידי השפעה של גורמים אחרים במורד הזרם לא קשור לטאו גרעיני.

כאן, אנו מספקים שיטה שיכולה לפתור בעיה זו על ידי ניצול הליך קלאסי כדי לבודד את התא הגרעיני בשילוב עם השימוש של בונה הטאו 0N4R מתויג עם לוקליזציה גרעינית (NLS) או אותות היצוא הגרעיני (NES). גישה זו מבטלת את הסוגיות המורכבות הקשורות לחפצי האמנות האפשריים בשל הגלישה של מולקולות טאו מהתא cytoplasmic. יתר על כן, המבנים של טאו-NLS וטאו-נס מעניקים להעשרה או להדרה של מולקולות של הטאו מהתא הגרעיני, בהתאמה, מתן שליטה חיובית ושלילית למעורבות של מולקולות באוניברסיטת טאו גרעינית בפונקציה מסוימת. הפרוטוקול הוא מבחינה טכנית קל והוא מורכב שיטות קלאסיות ואמינות, כי הם החלים באופן כללי כדי ללמוד את הפונקציה הגרעינית של הטאו בסוגי תאים אחרים, הבדיל או לא, כמו תאים סרטניים להפעיל מחדש את הביטוי טאו20,21. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים הנמצאים הן הציטופלסמה ואת הגרעין על מנת לנתח פונקציות ביולוגיות הקשורות לתאים שונים.

Protocol

1. תרבית תאים תרבות SH-SY5Y תאים (קו תאים נוירובלסטומה האדם, CRL-2266) בינונית לחלוטין (מדיום הנשר שונה של בינונית: תערובת מזינים F12 [DMEM/F-12] בתוספת עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ”מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין 100 μg/mL סטרפטומיצין). לשמור על התאים בחממה ב 37 ° צ’ ו 5% CO2. לגדול תאים ב 10 ס מ לוחות ולפצל כאש…

Representative Results

האסטרטגיה המשמשת לנתח את ההשפעה של טאו גרעיני ביטוי גנים הימנעות מתרומת חלבונים cytoplasmic טאו מתוארת באיור 1. בקצרה, החלבונים של טאו שתויגו עם NLS או NES נצברים או אינם נכללים בתא הגרעיני, בהתאמה. ההשפעה הפונקציונלית של חוסר איזון זה הוא שינוי של ביטוי הגנים שנמד…

Discussion

אנו מתארים שיטה למדוד את ההשפעה של חלבון הטאו גרעיני על ביטוי גנים. עם הפרוטוקול הזה התרומה. של cytoplasmic טאו מוגבלת מאוד צעדים קריטיים של פרוטוקול זה הם הבאים: הבידול של האדם נוירובלסטומה SY5Y תאים, את השבר הסלולר ואת הלוקליזציה של חלבון הטאו בתא הגרעיני.

ראשון, כפי שמוצג בסעיף תו…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Scuola Normale הסופרור (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

Referenzen

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically – The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemie. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer’s Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer’s Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

View Video