Arricchimento e rilevamento di Clostridium perfezioni tossinotipi nei campioni di alimenti al dettaglio

NOTA: C. perfringens è considerato un organismo di livello 2 (BSL2) di pericolo di biosicurezza. Anche se non tutti i campioni di cibo conterranno C. perfringens, tutti i campioni coltivati dovrebbero essere trattati come tali. Tutte le precauzioni adeguate e le attrezzature protettive per il personale (PPE) devono essere indossate in ogni momento. Decontaminare tutto il materiale prima dello smaltimento. 1. Preparare l’RPM modificato4,15 Unire 30 g/L di tiogolicololate medio, 60 g/L di gelatina, 5 g/l peptone, 5 g/L di glucosio, 5 g/L didiete fosfato dibasic, 3 g/L di estratto di lievito, 1,5 g/L di cloruro di sodio, 0,5 g/L ferrousso solfato in acqua dionizzata fino a disperarsi in modo uniforme. In genere creiamo lotti da 1 L. Autoclave a 121 gradi centigradi per 15 min. Lasciar raffreddare a circa 40 gradi centigradi. Una volta RPM è fresco, aggiungere D-cycloserine ad una concentrazione finale di 440 mg/L.NOTA: Le concentrazioni di valori di D-cicloserina disciolte in acqua sterile a 50 mg/mL possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un uso futuro. Trasferire aquanto pareccosa mente 10 mL di RPM a tubi conici da 15 mL. L’RPM può essere preparato in lotti e conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di un mese. Caldo RPM a 37 gradi centigradi prima dell’uso. 2. Raccolta di campioni e incubazione RPM Trasportare alimenti in laboratorio a temperature ambiente entro 1 h. Gli alimenti possono essere trasportati in imballaggi originali o contenitori sterili. Se non si prova immediatamente, il cibo può essere conservato a -20 gradi centigradi fino all’uso. Prendere nota del tipo di alimento e del paese di origine in base all’etichetta di imballaggio, se disponibile, nonché qualsiasi altra informazione pertinente. Rimuovere circa 1,0–2,0 g di cibo e trasferirli nella sterile parabola Petri o equivalente. Tritare finemente con una lama sterile di rasoio o bisturi. Inoculare in 10 mL di fosfato buffers salina (PBS) in un tubo conico da 15 mL. Mescolare bene. Per selezionare per le cellule vegetative, trasferire 5 mL della miscela PBS-food in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPM. Fissare saldamente il coperchio. Per selezionare per le spore, riscaldare i restanti 5 mL di miscela pbS-alimenti a 85 gradi centigradi per 15 min e quindi trasferire in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di RPM. Fissare saldamente il coperchio. Vorticare e invertire le colture food-RPM per garantire una miscelazione completa. Sigillare saldamente i tubi conici e avvolgere i coperchi con pellicola di paraffina o pellicola trasparente per garantire un ambiente anaerobico. Incubare durante la notte (ON) a 37 . La mattina seguente notare qualsiasi torbidità o fermentazione nei tubi RPM. 3. TSC “sandwich” placcatura Inoculare le impostazioni cultura RPM ON in TSC agar utilizzando una tecnica “sandwich” (Figura 2) descritta di seguito. Preparare l’agar TSC in base alle istruzioni del produttore. Preparare lo strato di base delle piastre TSC trasferendo 10 mL di agar TSC fuso a sterili piatti Petri e lasciare solidificare. Questi possono essere preparati in avanzata e conservati a 4 gradi centigradi. Assicurarsi che le piastre siano riscaldate a temperatura ambiente prima dell’uso. Per lo strato superiore della piastra TSC, mantenere l’agar TSC fuso rimanente a 40 gradi centigradi.NOTA: Anche se il punto di fusione dell’agar è superiore agli 85 gradi centigradi, l’agar fuso si solidifica intorno ai 32-45 gradi centigradi. Recuperare con attenzione le colture ON RPM e trasferire 100 l all’agar TSC. A causa della fermentazione, alcune culture possono essere sotto pressione. Assicurarsi di indossare tutto il PPE appropriato. Stendere l’inoculo RPM utilizzando perline di vetro sterilizzato o spalmatore cellulare. Lasciare che l’RPM venga “assorbito” nell’agar TSC per 5-10 min a temperatura ambiente. Trasferire con cura 20 mL di fuso, 40 c’agar tramite piastra utilizzando una pipetta sierologica. Sostituire il coperchio della teglia Petri e lasciare che l’agar TSC si solidifichi completamente a temperatura ambiente. Invertire il piatto Petri e incubare a 37 gradi centigradi. Se si desidera comporre le diluizioni seriali, eseguire le diluizioni delle impostazioni cultura ON RPM in RPM freschi e preriscaldati prima dell’inoculazione nell’agar TSC. 4. Sottocoltura di colonie che riducono il solfato La mattina seguente, rimuovere le piastre dall’incubatrice ed esaminare la crescita batterica. I batteri aerobici possono essere presenti sulla superficie dell’agar. I batteri anaerobici saranno trovati in crescita incorporato all’interno dell’agar. I batteri che riducono il solfato diventeranno neri circostanti l’agar. Possibili colonie C. perfringens saranno nere e incorporate nell’agar. C. perfezioni colonie sospette saranno positive per la riduzione del solfato e appariranno nere, incorporato all’interno dell’agar. Utilizzando un contagocce sterile e monouso, “pizzicare” le colonie nere dall’agar e trasferire a 10 mL di RPM fresco in un tubo conico da 15 mL. È importante che l’aria dal contagocce venga espulsa prima di perforare l’agar. Se c’è una fitta quantità di crescita batterica aerobica sulla superficie della piastra, utilizzare un raschietto a cellule sterili per rimuovere colonie da aree selezionate. Più C. perfringens colonie sospette possono essere campionati dalla stessa piastra TSC in colture RPM separate. Coperchi tubo conico strettamente sicuri e avvolgere in pellicola di paraffina o pellicola trasparente. Incubare ON a 37 gradi centigradi. 5. Estrazione del DNA Rimuovere le colture RPM ed esaminare i segni di crescita tra cui torbidità e fermentazione. Invertire delicatamente la coltura RPM per disperdere eventuali batteri depositati e aprire con attenzione. Trasferire 1 mL della coltura in un tubo di microcentrifuga. Centrifuga alla massima velocità (circa 15.000 x g) per 10 min a pellet batteri. Lavare il pellet con 1 mL di PBS sterile. In alcune circostanze, la gelatina non digerita si deposita sopra i batteri pelletti. Per rimuovere la gelatina, “fluff” dalla gelatina agitando delicatamente con PBS utilizzando una micropipetta. Questo “fluff-up” la gelatina lasciando il pellet batterico intatto. Rimuovere la miscela PBS-gelatina con aspirazione delicata. Sospendere nuovamente il restante pellet batterico con 1 mL di PBS fresco. Centrifugare il pellet batterico risospeso alla massima velocità per 10 min e aspirare con attenzione il supernatante. Eseguire immediatamente l’estrazione del DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA e un protocollo creato appositamente per l’estrazione del DNA dai batteri Gram-positivi (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare il DNA estratto immediatamente o conservare a -20 gradi centigradi fino all’analisi PCR. 6. Rilevamento di c. perfringens tramite genotipizzazione PCR Per determinare se le colture sono positive per i tossinotipi Di C.perfringens, esaminare il DNA estratto per diversi geni di tossina tramite PCR.NOTA: Poiché siamo più interessati alla tossina epsilon che produce ceppi di tipo B e D C. perfringens, valutiamo la presenza dei geni della tossina alfa, beta ed epsilon. I Primer sono elencati nella Tabella 2. I primer per il DNA ribosomico 16s sono usati come controllo di estrazione del DNA. Ulteriori primer possono essere utilizzati per testare i tossinotipi da A a G e possono essere trovati nella letteratura pubblicata2,12,13. Utilizzare c. viola il DNA come controllo positivo. Questo controllo assicura che tutti i componenti delle reazioni PCR funzionino. Usiamo il DNA estratto da C. perfringens tipo B (ATCC 3626) come nostro controllo positivo. Coltivare ATCC 3636 ON in RPM a 37 gradi centigradi ed estrarre il DNA utilizzando gli stessi metodi descritti nei passaggi da 5.1 a 5,7. Conservare il DNA estratto a -20 gradi centigradi fino all’uso. Impostare le condizioni pcR come segue: 94,0 c per 3 min; 94,0 gradi centigradi per 30 s; 47,9 gradi centigradi per 30 s, 72,0 gradi centigradi per 1 min (ripetere i passaggi da 2 a 4 per 35 cicli); 72,0 gradi centigradi per 10 min. Per confermare i prodotti PCR, eseguire le reazioni PCR su un gel di agarose da 1,8 g/100 mL utilizzando tecniche standard. Le dimensioni previste per i prodotti PCR sono elencate nella tabella 2. I tipici risultati PCR vengono visualizzati nella Figura 3.