Qui presentiamo un protocollo per la scissione dell’RNA dipendente da DNAzyme. Ciò consente un’analisi rapida e dipendente dal sito dell’RNA 2′-O-metilazione. Questo approccio può essere utilizzato per la valutazione preliminare o importante dell’attività dello snoRNA.
Riquadro guida C/D piccoli RNA nucleolari (snoRNA) catalizzano 2′-O-metilazione dell’RNA ribosomal e nucleare piccolo. Tuttavia, un gran numero di snoRNA in eucarioti superiori può riconoscere promiscuamente altre specie di RNA e 2′-O-metilato più bersagli. Qui, forniamo una guida passo-passo per l’analisi rapida e non costosa della metilazione 2’O-o-metilazione specifica del sito utilizzando un metodo ben consolidato che impiega oligonucleotidi di DNA corti chiamato DNAzymes. Questi frammenti di DNA contengono sequenze catalitiche che fendeno l’RNA in posizioni di consenso specifiche, così come bracci di omologia variabile che indirizzano il Dna ai suoi bersagli di RNA. L’attività del DNAzyme è inibita da 2-‘O-metilazione del nucleotide adiacente al sito di scissione nell’RNA. Così, i DNAzymes, limitati solo dal consenso della sequenza scissionda, sono strumenti perfetti per la rapida analisi dell’RNA 2′-O-metilazione mediata dallo snoRNA. Abbiamo analizzato snoRNA snR13- e snR47-guidato 2’-O-metilazione di 25S ribosomico IN Saccharomyces cerevisiae per dimostrare la semplicità della tecnica e per fornire un protocollo dettagliato per il saggio dipendente da DNAzyme.
Le modifiche dell’RNA svolgono un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica. RNA 2′-O-metilazione e pseudouridilazione, che sono guidati da scatola C/D e scatola H/ACA piccoli RNA nucleolari (snoRNA) rispettivamente, proteggere l’RNA dalla degradazione e stabilizzare le loro strutture di ordine superiore1,2,3 . Gli obiettivi di SnoRNA sono stati identificati principalmente negli RNA ribosomici (rRNA) e nei piccoli RNA nucleari (snRNA). Tuttavia, negli eucarioti superiori, ci sono potenzialmente centinaia di snoRNA senza funzioni assegnate e alcuni di loro possono riconoscere più RNA1,4,5,6,7. Pertanto, i metodi che consentono l’identificazione e l’analisi delle modifiche guidate dallo snoRNA sono strumenti importanti per scoprire i meccanismi che regolano i processi cellulari.
Un sito di putazione 2′-O-metilazione a cimpianto guidato dallo snoRNA C/D può essere identificato bioinformaticamente e confermato sperimentalmente da molte tecniche, tra cui la scissione diretta da RNase H, o metodi site-specific e a livello di genoma, che impiegano la trascrizione inversa nei nucleotidi bassi (dNTP) l’approccio alla concentrazione8,9,10,11. Queste tecniche sono molto sensibili, ma anche laboriose e costose, quindi, potrebbero non essere adatte per il test iniziale o rapido. Uno dei metodi più semplici e a basso costo per identificare i siti di metilazione 2′-O-o-metilazione è la cleavazione dell’RNA dipendente dal DNAzyme12. I DNA sono molecole di DNA corte, a filamento singolo e catalicamente attive in grado di scissione endonucleolitica di RNA in posizioni specifiche. Sono costituiti da una sequenza di base conservata e cataliticamente attiva e bracci di legame 5 e 3′ composti da sequenze variabili progettate per ibridare da Watson-Crick base-pairing al bersaglio RNA (Figura 1). Così, le braccia 5′ e 3 ‘ forniscono la sequenza catalitica al sito specifico dell’RNA. La scissione dipendente dal DNAzyme è inibita dalla metilazione 2’-O-metilazione del nucleotide posizionato direttamente a monte del sito di scissione12,13. Questo rende i DNAzymes strumenti molto pratici per l’analisi dei siti putativi o noti di RNA 2′-O-metilazione.
Due tipi di DNAzymes sono utilizzati per le modifiche dell’RNA analisi12. La sequenza attiva di 10-23 DNAzyme (Figura 1A) è costituita da 15 nucleotidi (5’RGGCTAGCTACACGA3′) che formano un ciclo intorno alla dinucleotide RNA purina-pirimidina (RY) mirata e catalizzano la scissione tra questi due nucleotidi. La purina dell’RNA (R) non è accoppiata alla base con il DNAzyme e la metilazione 2′-O-metilazione presente sul DNAzyme inibisce la scissione. I bracci di legame di 10-23 DNAzymes sono di solito lunghi 10-15 nucleotidi. La seconda classe DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figura 1B) contiene una sequenza catalitica a 14 nucleotidi (5’TCCCCGGACGA3′). Nucleotides C2, C3 e G4 coppia con C9 G10 e G11 formando una struttura breve stelo-loop. 8-17 DNAzymes fende l’RNA a monte di qualsiasi guanino che sia perfettamente abbinato alla prima timina della sequenza attiva DNAzyme. Il nucleotide dell’RNA a monte della guanina non è accoppiato alla base con il DNAzyme e la sua metilazione 2′-O-metilazione compromette la scissione. 8-17 DNAzymes richiedono bracci omologia più lunghi di circa 20 nucleotidi per indirizzare il DNAzyme alla sua sequenza specifica.
Qui, forniamo un protocollo passo-passo per l’analisi di 2′-O-metilazione di rRNA in Saccharomyces cerevisiae utilizzando 10-23 e 8-17 approcci dipendenti da DNAzyme12,13 (Figura 1C). Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri organismi e specie di RNA e impiegato per le analisi rapide, preliminari o principali dell’RNA 2′-O-metilazione site-specific.
La digestione dipendente da DNAzyme può essere utilizzata come metodo semplice e rapido per analizzare l’RNA 2′-O-metilatura specifico del sito12,13. I DNAzymes freno l’RNA se il nucleotide a monte del sito di scissione non è metilato. A differenza di altri approcci, tra cui la digestione diretta da RNase H, la degradazione alcalina o la trascrizione inversa nella bassa concentrazione di nucleotidi seguita da PCR quantitativo o sequenziamento8,10,11 ,16, approccio DNAzyme richiede un semplice oligonucleotide del DNA e reagenti di base che sono presenti in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare. Inoltre, i DNAzymes possono essere utilizzati in modo simile per analizzare la pseudouridilazione dell’RNA mediata dalla scatola H/ACA snoRNA12, che li rende strumenti versatili nello studio dei bersagli dello snoRNA.
Gli approcci dipendenti da DNAzyme sono limitati solo dalle sequenze di consenso del sito di scissione17. 10-23 DNAzymes possono essere utilizzati per analizzare 2′-O-metilazione solo nella posizione R del dinucleotide RY, mentre 8-17 DNAzymes riconoscono la modifica del nucleotide situato a monte della guanina. Di conseguenza, non è possibile analizzare modifiche come la metilazione 2′-O-metilazione del primo nucleotide nei dinucleotidi guanine-adenina (GA), adenina (AA), pirinesina (YA) e pirimidina (YY). Inoltre, la bassa efficienza della scissione dipendente dal DNAzyme12 dovrebbe essere considerata. Sebbene alcuni DNAzymes frenino l’RNA quasi completamente (Figura 3B), molti DNAzimes digeriscono solo parzialmente i loro obiettivi (Figura 3B). L’efficienza può dipendere dalla sequenza che circonda il sito di scissione. Ad esempio, le regioni dell’RNA con distese dello stesso nucleotide possono influenzare il corretto posizionamento della sequenza attiva DNAzyme. Inoltre, le regioni dell’RNA che formano una forte struttura secondaria possono re-ibridare e sopprimere il legame di DNAzyme alla sequenza bersaglio. Per superare questi problemi, cicli di riscaldamento e raffreddamento del 10-23 DNAzyme e del suo substrato di RNA possono essere applicati18.
Abbiamo usato l’approccio DNAzyme per studiare la metilazione 2′-O-metilazione del rRNA. Si può anche usare questa tecnica per analizzare altre modifiche dell’RNA, come N6-methyladenosine19. L’RNA ribosomico, grazie alla sua abbondanza, può essere analizzato mediante elettroforesi e i prodotti di scissione possono essere visualizzati sotto la luce UV. Tuttavia, questo non è applicabile per gli RNA meno abbondanti come gli RNA di codifica generati da RNA Polymerase II (mRNA) e gli RNA non codificanti (ncRNA). Questi RNA di solito non possono essere rilevati direttamente dalla colorazione dell’RNA nei gel di agarose o poliacrilammide. In questi casi, la scissione dipendente dalla DNAzyme può essere visualizzata mediante gonfiore settentrionale, rilevata indirettamente da PCR/PCR quantitativa o analizzata da PCR quantitativa con polimerasi (ad esempio, KlenTaq DNA Polymerase) in grado di discriminare RNA non metilato20,21.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Maya Wilson e Aneika Leney per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una Sir Henry Dale Fellowship finanziata congiuntamente dalla Wellcome Trust e dalla Royal Society (200473 / 16 / . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Chemicals | |||
Acid phenol | SIGMA | P4682 | |
Agarose | VWR | A2114 | |
Ammonium acetate | SIGMA | A1542 | |
Chlorophorm | Fisher scientific | 10293850 | |
DNase/RNase free water | Fischer Scientific | 10526945 | |
DNAzyme | Integrated DNA Technology | Custom oligo DNA | |
EDTA | SIGMA | E9884 | |
Ethanol Absolute | Fisher scientific | 10437341 | |
Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
Formamide | sigma | F9037 | |
Galactose | SIGMA | G0750 | |
Gel Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
Glucose | SIGMA | G7021 | |
Glycogen | Thermo Fisher Scientific | R0561 | |
HEPES | SIGMA | H3375 | |
Isoamyl | SIGMA | W205702 | |
KCl | SIGMA | P9333 | |
MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
MnCl2 | SIGMA | 244589 | |
MOPS | SIGMA | M1254 | |
NaCl | SIGMA | S7653 | |
Oxoid Peptone Bacteriological | Thermo Fisher Scientific | LP0037 | |
Oxoid Yeast Extract Powder | Thermo Fisher Scientific | LP0021 | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | EO0382 | |
SDS | SIGMA | 74255 | |
Sodium acetate trihydrate | SIGMA | S8625 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Tris base | SIGMA | TRIS-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
1.5 mL microtubes | Sarstedt | ||
152VR5C01M -80°C freezer | Thermo Fisher Scientific | ||
250 mL Erlenmeyer flasks | Cole-Parmer | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Combicup VX200 vortex | Appleton Woods | ||
DS-11 microspectrophotometer | Denovix | ||
Electrophoresis chamber (20 cm tray) | SIGMA | ||
FiveEasy F20 pH meter | Appleton Woods | ||
Gel documentation system | Syngene | ||
Heraeus Fresco 21 micro centrifuge | Fisher Scientific | ||
Megafuge 8R centrifuge with rotator suitable for 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | ||
Mini Fuge Plus mini centrifuge | Starlab | ||
Mixer HC thermal block | Starlab | ||
OLS26 Shaking Water Bath | Grant | ||
PowerPac power supplier | BioRad |