PdMS tabanlı, çok katmanlı, mikroakışkan bir cihazın in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) reaksiyonlarının uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesine olanak sağlayan üretim süreci anlatılmaktadır. Ayrıca, bu reaksiyonları uzun süre ler boyunca otomatikleştirmek ve korumak için gereken donanım ve yazılıma kapsamlı bir genel bakış sağlanır.
Araştırmacılar daha büyük ve daha karmaşık sentetik genetik düzenleyici devreler geliştirmeyi amaçladıkça hücre temelli sentetik biyolojinin sınırlamaları giderek daha belirgin hale geliyor. In vivo sentetik genetik düzenleyici ağların analizi zaman alıcı dır ve çevresel kontrol eksikliğinden muzdariptir, eksojen sentetik bileşenler ev sahibi süreçleri ile etkileşime girerek istenmeyen davranışlara yol açar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, yeni devrelerin hücresiz karakterizasyonu daha yaygın hale gelmektedir. In vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) karışımları deneysel ortamın düzenlenmesine olanak sağlar ve her benzersiz sistem için optimize edilebilir. Burada sunulan protokoller, uzun süre ler için IVTT reaksiyonlarını sürdürmek için kullanılabilen çok katmanlı bir mikroakışkan cihazın imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Kaynakların zaman içinde tükendiği ve (by-) ürünlerin biriktiği toplu reaksiyonların aksine, mikroakışkan cihazların kullanımı kaynakların yenilenmesine ve reaksiyon ürünlerinin çıkarılmasına olanak sağlar. Bu şekilde hücresel ortam, gen devrelerinin dinamik davranışlarının uzun süre araştırılabildiği denge dışı bir ortam korunarak taklit edilir. Çok katmanlı mikroakışkan cihazdan tam olarak yararlanmak için, IVTT reaksiyonlarını otomatikleştirmek için donanım ve yazılım entegre edilmiştir. IVTT reaksiyonlarını burada sunulan mikroakışkan platformla birleştirerek, karmaşık ağ davranışlarını kapsamlı bir şekilde analiz etmek mümkün olur ve hücresel süreçleri düzenleyen mekanizmalar hakkında anlayışımızı ilerletebilirsiniz.
Hücreler karmaşık dinamik düzenleyici ağlar1,2kullanarak kendi ortamlarını algılamak ve yanıt edebiliyoruz. Sentetik biyoloji alanında hücrelerin işlevselliğini genişletebilir biyolojik sistemler tasarlamak için bu ağları oluşturan doğal olarak oluşan bileşenlerin bilgimizi kullanır3,4. Buna karşılık, mevcut devrelerin basitleştirilmiş, sentetik analoglarını veya doğal olarak meydana gelen davranışlar sergileyen ileri mühendislik biyolojik sistemleri tasarlayarak yaşamı yöneten doğal ağları daha iyi anlamamızı da mümkündür. Bu tür biyolojik sistemlerin de novo mühendislik yeni genetik devreler veya sinyal yolları rasyonel bir şekilde, iyi tanımlanmış parçalar5,6kullanılarak tasarlanmış bir aşağıdan yukarıya bir şekilde gerçekleştirilir. Ağların rasyonel tasarımının biyolojik olarak ilgili sistemlerin tasarımı ile birleştirilmesi, biyolojik düzenleyici sistemlerin derinlemesine karakterizasyonuve incelenmesini çeşitli soyutlama düzeyleriyle mümkün kılar7.
Elowitz ve Leibler8 ve Gardner ve ark.9’un öncü çalışmaları sentetik genetik ağların hücresel konaklara başarılı bir şekilde girişini gösteren ilk çalışmalardır. Takip eden on yıl içinde, çok sayıda araştırmacı hücrelere sentetik devrelerin giriş ile ilgili çeşitli sınırlamalar ortaya çıkmasına rağmen bu ilk başarıları üzerine inşa etmeye devam etmiş7,10,11 ,12. İdeal olarak, hücresel konaklar içine sentetik devrelerin giriş modüler bir şekilde meydana gelmelidir. Ne yazık ki, hücresel ortamın karmaşıklığı bu özellikle zor hale getirir, birçok parça ve ağların fonksiyonu ile son derece bağlam bağımlı12,13,14. Sonuç olarak, ağlar genellikle sentetik devrenin işlevini etkileyebilecek yerli ana bilgisayar bileşeni ile istenmeyen etkileşimler yaşarlar. Benzer şekilde, eksojen ağın bileşenleri ev sahibi süreçleri inhibe edebilir, ana bilgisayar içinde paylaşılan kaynaklar için rekabet, ve büyüme kinetik etkisi15,16,17. Sonuç olarak, sentetik ağların in vivo bir ortamda ki davranışını rasyonel bir şekilde tasarlamak ve tahmin etmek için, tüm ana bilgisayar ve devreye özgü dinamiklerin kapsamlı bir modeli18gereklidir.
Sentetik ağların karakterizasyonu için hücresel ana bilgisayarların kullanımına uygun bir alternatif in vitro transkripsiyon ve çeviri (IVTT) teknolojilerinin uygulanmasıdır. Sentetik ağlar için bir test yatağı olarak hareket eden reaksiyonlar, gen ekspresyonunu sağlamak için gerekli tüm bileşenleri içeren çözeltilerde gerçekleştirilir19,20,21. Bu şekilde, bir biyolojik ilgili, yapay da olsa, çevre içinde sentetik ağlar test edilebilir oluşturulur22,23,24,25,26, 27,28. IVTT çözümleri kullanmanın en büyük avantajı, araştırmacıların her reaksiyonun kesin bileşimini ayarlayabilmeleri ile kullanıcı tarafından belirtilen koşullar altında reaksiyon lar gerçekleştirebilme yeteneğidir2. Ayrıca, hücre içermeyen yaklaşım sentetik ağların yüksek iş yapma yoluyla test edilmesini sağlar, çünkü zaman alan hücresel klonlama adımlarını gerçekleştirme ihtiyacını ortadan kaldırır. Sonuç olarak, ardışık tasarım süresi – inşa – test döngüleri önemli ölçüdeazalır 29,30,31,32. Tasarım döngüsü, Gibson montajı gibi hücresiz klonlama tekniklerini kullanarak yeni ağları hızla geliştirerek ve in vivo test için gerekli plazmidlerin aksine doğrusal DNA şablonlarından ağlar oluşturarak daha da hızlandırılabilir. polimeraz zincir reaksiyonları (PCR)33,34ile güçlendirilebilir.
Toplu reaksiyonlar, tüm reaksiyon bileşenlerinin birleştiği tek bir reaksiyon kabı gerektiren, IVTT reaksiyonlarının yapılabildiği en basit yöntemdir35. Bu tür reaksiyonlar protein ekspresyonu için yeterlidir ve temel devre testi bir ağın uzun vadeli dinamik davranışını incelemeye çalışırken yetersiz kalır. Toplu işlem boyunca reaktifler ya tükenir ya da transkripsiyon ve çeviri oranlarında sürekli bir düşüşe neden olur. Ayrıca, reaksiyonlar ilerledikçe yan ürünler, ağın doğru işleyişini engelleyebilecek veya tamamen engelleyebilecek biriktikçe. Sonuçta, toplu reaktörlerin kullanımı gözlemlenebilir dinamik davranışı sınırlar, negatif düzenleme özellikleuygulamakiçin zor olan 5,36.
IVTT sistemlerinin çok yönlülüğü, sürekli akıştan damlacık bazlı yöntemlere ve daha basit diyaliz yaklaşımlarına kadar uzun süreli IVTT reaksiyonlarının uygulanabileceği birden fazla alternatif yöntem e-sataşabilir. 37,38,39,40. Mikroakışkan cihazların uygulanması, kullanıcılara reaksiyonları üzerinde daha fazla kontrol sağlarken, iş bürünme ve maliyetleri en aza indirme35,41,42, her bir yaklaşım la kendi avantajları. Sürekli akış kullanımı kolayca ifade verimleri artırmak için optimize edilebilir ancak, etkili belirli reaksiyon ürünleri kaldırmak için yetersizlik dinamik davranış önemsiz olmayan çalışma yapar39. Damlacık tabanlı mikroakışkan sistemler istihdam ederken yeni ağların yüksek işlem tarama sağlarken, küçük hacimli toplu reaksiyonlar benzeyen damlacıklar reaksiyon sonuçları taze reaktifler tedarik zorluk43. Diyaliz bazlı reaktörler taze reaktiflerin piyasaya sürülmesinin yanı sıra bazı reaksiyon ürünlerinin çıkarılmasına izin verir, Ancak, RNA molekülleri ve daha büyük proteinler reaktör içinde birikir, membran gözenekleri ile yaymak için çok büyük olmak. Ayrıca, reaktifler büyük hacimli uzun süre ler için bu reaksiyonları sürdürmek için gereklidir30,44. 2013 yılında, Maerkl ve ark. uzun süreli IVTT reaksiyonları36,45yürütmek için özel olarak tasarlanmış çok katmanlı bir mikroakışkan cihaz sundu. Çok katmanlı mikroakışkan cihazların kullanımı sıvı akışı üzerinde doğrudan kontrol sağlar, akış yeniden yönlendirilmesi yanı sıra cihazın belirli bölgelerinde sıvı izolasyonu için izin46,47. Bu izole bölgeler, IVTT reaksiyonları yapIlebilen bağımsız nanolitre ölçekli reaksiyon odaları olarak işlev görebilir. Tek bir IVTT reaksiyonu boyunca, reaktöre taze reaktiflerin periyodik enjeksiyonları IVTT bileşenlerini ve DNA şablonlarını doldurmak için kullanılır. Aynı anda, eski reaksiyon çözeltisinin eşit hacimli, reaksiyon ürünleri kaldırarak yerinden edilir. Bu şekilde, bazal transkripsiyon ve çeviri oranlarının sabit durumda kaldığı, IVTT reaksiyonlarının ömrünü uzatarak ve zengin dinamik davranışların oluşmasına izin veren bir denge dışı ortam korunur. Araştırmacılar bu yaklaşımı uygulayarak, yeni genetik ağların ileriye mühendislik yardımcı, belirli bir devre içinde meydana gelen bireysel süreçlerin kinetik oranlarını araştırmak mümkün. Örneğin, Niederholtmeyer ve ark. bir genetik halka osilatör çeşitli unsurları karakterize etmek için bu yaklaşımı uyguladı, bunların kinetik oranlarını belirleyen36. Daha ileri çalışmalarda Yelleswarapu ve ark. toplu koşullar altında belirlenen sigma faktörü 28 ‘in kinetik oranlarının (σ28)σ28tabanlı osilatörün davranışını tanımlamak için yetersiz olduğunu ve akış tabanlı verilerin eklenmesinin ağ davranışı geliştirilmiş model tahminleri22.
Bu makalenin amacı, uzun süreli IVTT reaksiyonları gerçekleştirebilen çok katmanlı mikroakışkan cihazların imalatı için tam bir protokol sunmaktır. Buna ek olarak, bu el yazması uzun süreli IVTT reaksiyonları gerçekleştirmek için gerekli tüm donanım ve yazılım açıklanacaktır. Mikroakışkan cihazın harekete alınması – orada sıvıların akışını kontrol etmek için gerekli – tüp uzunlukları ile mikroakışkan cihazlara doğrudan bağlanmak pnömatik vanalar bir dizi kullanılarak elde edilir. Buna karşılık, pnömatik vanalar özel olarak üretilmiştir sanal kontrol arayüzü üzerinden kontrol edilir. Mikroakışkan cihazların içindeki sıvı akışı, ticari olarak kullanılabilen basınç düzenleme sistemi tarafından sağlanan sürekli basınç kullanılarak elde edilir. IVTT reaksiyonları genellikle 29 °C ile 37 °C arasında gerçekleştirilir ve reaksiyonlar sırasında sıcaklığı düzenlemek için bir mikroskop kuluçka makinesi kullanılır. Ancak IVTT karışımının işlevselliği 4 °C’nin üzerinde depolandığında yavaş yavaş bozulur. Bu nedenle, bu el yazması mikroakışkan cihaziçine enjeksiyondan önce IVTT karışımı soğutmak için kullanılan off-chip soğutma sistemi genişletecektir. Sonuç olarak, bu el yazması, diğer araştırmacıların bu teknolojiyi göreceli olarak kopyalayabilmeleri için mikroakışkan akış reaktörü kullanarak uzun süreli IVTT reaksiyonlarını başarıyla gerçekleştirmek için gereken prosedürlerin kapsamlı bir özetini sunmaktadır. Kolay -lığı.
PDMS tabanlı çok katmanlı mikroakışkan bir cihaz sunulmuştur ve IVTT reaksiyonlarını uzun süre devam ettirme yeteneği gösterilmiştir. Bu özel örnek için uygun olsa da, bu teknoloji birçok diğer uygulamalar için kullanılabilir. Sıvı akışı üzerindeki ek kontrol – ürünleri çıkarırken reaksiyon reaktiflerini sürekli olarak yenileme yeteneği ile eşleştirilmiştir – sürekli sentez reaksiyonları, çeşitli dinamik davranışların araştırılması ve eşzamanlı tek bir reaksiyonun birden fazla varyasyonunun iletimi.
PDMS tabanlı cihazların nispeten basit üretim sürecine rağmen, bunların kullanımı kapsamlı bir donanım kurulumu gerektirir. Vana dizileri, basınç regülatörleri, basınç pompaları, kuluçka makineleri ve soğutma ünitelerinden oluşan üretimden kullanıma geçiş temel değildir ve önemli bir ilk yatırım gerektirir. Buna ek olarak, bu aygıtlarla sürekli olarak kurulum ve başarılı denemeler yapabilme yeteneği önemli bir zaman yatırımı gerektirir; bu makalenin ele almayı hedeflediği bir nokta. Ancak, bir kez yerine, tüm kurulum çeşitli amaçlar için değiştirilebilir. Ayrıca, donanım kurulumu çok sayıda modüler elemandan oluşur ve bunların her biri daha karmaşık mikroakışkan cihaz tasarımlarının kullanılabilir hale getirilebilmesi için genişletilebilir. Ayrıca, modüler tasarım benzer işleyen alternatifler tarafından donanım bileşenlerinin değiştirilmesine olanak sağlar, kullanıcıların burada açıklanan belirli kurulum ile sınırlı değildir gibi48,49.
Tek tek aygıtlar arasında ve dış koşullardaki değişkenlik (basınç dalgalanmaları gibi) bu aygıtları kullanırken denemeler yaparken yanlışlıklara neden olabilir. Bu sorunu gidermek için, her denemeden önce sistemin kalibrasyonu yapılmalı dır ve bu da reaktörlerin her biri için benzersiz bir Yenileme Oranı sağlamaktadır. Kalibrasyon cihazdan cihaza ve deneyden deneye varyasyonları ele alırken, bu zaman alıcı bir süreçtir ve kusursuz değildir. Farklı viskozitelere sahip sıvılar aynı basınca maruz kaldığında aynı oranda akmaz ve bu nedenle birden fazla reaktifle kalibrasyon un gerçekleştirilmesi aynı Yenileme Oranlarınıvermeyebilir. Bu etki, reaktifleri peristolarak mikroakışkan cihaza pompalamak için üç kontrol kanalı kullanılarak zayıflatılır, ancak verilen basıncı değiştirerek akışı düzenlemenin aksine. Viskozitede eşitsizliğinin çok büyük olduğu durumlarda son çare olarak, birden fazla kalibrasyon deneyi gerçekleştirerek her bir reaktif için benzersiz bir Yenileme Oranı uygulanabilir.
Mikroakışkan cihaza reaktifler enjekte etmek için peristaltik bir pompa kullanımı, farklı viskozitelere sahip çözümler kullanmanın etkilerini zayıflatır, ancak aynı zamanda ikincil bir sorun oluşturur. Mikroakışkan cihaza sıvı pompalamak için ayrı adımlar kullanılması, enjeksiyonların tek bir reaktöre çözündeğin, tek bir pompa çevrimi gerçekleştirirken enjekte edilen hacimle sınırlı olduğu anlamına gelir. Araştırmamızda kalibrasyon sırasında belirlenen bu değer yaklaşık %1’e eşittir ve bu da tek bir pompa döngüsünün reaktör hacminin yaklaşık %1’ini (yaklaşık 0,1 nL) yerinden ettiğini gösterir. Bu nedenle, reaktör hacminin %30’unun yerinden edilmesi için 30 pompa çevriminin uygulanması gerekirken, IVTT reaksiyon çözeltisinin 23 pompa döngüsü ekleniyor ve sadece 7 pompa çevrimi DNA veya ultra saf su ekleniyor. Araştırmamız için yeterli olsa da, alternatif deneysel protokoller daha fazla sayıda benzersiz reaktif eklemeye çalışırken, daha düşük bir Yenileme Fraksiyonukullanmaya veya bir reaktöre tek bir reaktifin daha küçük hacimlerini eklemeye çalışırken sorunlarla karşılaşabilir. Bu gibi durumlarda, mikroakışkan cihaz tasarımı reaktörlere daha büyük hacim sağlamak için uyarlanabilir. Böyle bir örnek Niederholtmeyer ve ark36bildirilir.
En önemlisi, bu makalenin içinde özetlenen cihaz, tepkilerin uzun süre ler boyunca sürdürülmesini ve sabit durum transkripsiyon ve çeviri oranlarıyla sonuçlanmasına olanak tanır. Reaktörlere periyodik olarak yeni reaktifler enjekte edilerek – ve reaksiyonu (by) ürünleri kaldırarak – reaksiyonlar sürdürülür ve karmaşık dinamik davranışlar izlenebilir. Bu şekilde, bir platform oluşturuldu – bir dereceye kadar – hücresel ortamı taklit eder. Ayrıca, bu platform enjeksiyonlar arasındaki dönemi ve enjeksiyonların özel bileşimini uyarlayarak sistem dinamiğinin araştırılmasını sağlar. Sonuç olarak, bu çok katmanlı mikroakışkan cihazlar, karmaşık dinamik davranışlar sergileyen yeni sentetik ağların karakterizasyonu ve optimizasyonu için güçlü bir araçtır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nün (NWO, 723.016.003) NWO-VIDI hibesi olan Avrupa Araştırma Konseyi ERC (proje n. 677313 BioCircuit) tarafından desteklenmiştir. programları, 024.001.035 & 024.003.013), İnsan Sınır Bilim Programı Hibe RGP0032/2015, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı Grant 723106 altında Avrupa Araştırma Konseyi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe 200021_182019.
Reagents | |||
Acetone | VWR | 20063.365 | |
AZ 40 XT | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Positive Photoresist |
AZ 726 MIF Developer | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | – | Developer Positive Photoresist |
Isopropanol | Merck KGaA (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
Microscope slides | VWR | ECN 631-1550 | |
mr Dev 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | – | Developer Negative Photoresist |
Silicon Free Heat Sink Grease | Circuit Works | CW7270 | Thermal Compound |
Silicon wafers | Silicon Materials | – | <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness |
SU-8 3050 | Microchem Corp. (Newton, MA) | – | Negative Photoresist |
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) | The Dow Chemical Company | 01317318 | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | 8x |
Camera lens | The Imaging Source | – | |
Compression fitting | Koolance, Inc. | FIT-V06X10 | Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x |
Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
Device connecting tubing | Saint-Gobain Performance Plastics | AAD04103 | 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80) |
Device connector pins | Unimed SA (Lausanne, Switserland) | 200.010-A | AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L |
Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
Female bus connector | Encitech | DTCK15-DBS-K | 15 pole female bus connector |
Fluid reservoirs | Fluigent | Fluiwell-4C | |
Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 – 345 mbar |
Hg short arc lamp | Advanced Radiation Corporation | – | 350W |
Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
LabVIEW Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Liquid coolant | Koolance, Inc. | LIQ-705CL-B | |
Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | |
Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
Matlab Software | de Greef Lab, Eindhoven University of Technology | https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software | |
Microcamera | The Imaging Source | DMK 42AUC03 | |
Microscope camera | Hamamatsu Photonics | OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU) | |
Orbital shaker | Cole Parmer | EW-513000-05 | |
Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
PDMS puncher | SYNEO | Accu-Pucnh MP10 | |
PEEK tubing | Trajan | 1301005001-5F | 0.005" ID, 1/32" OD, Red |
Peltier element | European Thermodynamics | APH-127-10-25-S | |
Peltier temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | |
Photomask | CAD/Art Services, Inc. | – | |
Photomask Design | Maerkl Lab, EPFL | https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ | |
Pneumatic valve array | FESTO | – | 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves. |
Power adapter | Koolance, Inc. | ADT-EX004S | 110/220V AC Power Adapter |
PTFE tubing | Cole Parmer | 06417-21 | #24 AWG Thin Wall PTFE |
Punching pin | SYNEO | CR0320245N21R4 | OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm) |
PVC Tubing | Koolance, Inc. | HOS-06CL | 6 mm ID, 10 mm OD |
Single edge blades | GEM Scientific | – | |
Soft tubing | Fluigent | – | Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD) |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
Thermistor cable | Warner Instruments | TA-29 | Cable with bead thermistor |
UV exposure system | ABM, USA | – | Near UV Exposure System, 350W |
Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
Water cooled cold plate block | Koolance, Inc. | PLT-UN40F | |
Water cooler | Koolance, Inc. | EX2-755 | |
Weighing scales | Sartorius | M-prove |