Summary

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Published: May 01, 2019
doi:

Summary

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 ‘-unübersetzter Region (UTR) und 3 ‘-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

Abstract

Jedes Poxvirus mRNA, das nach der viralen DNA-Replikation transkribiert wurde, hat einen evolutionär konservierten, nicht temperierten 5 ‘-poly (A)-Anführer im 5 ‘-UTR. Um die Rolle des 5 ‘-Poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung während der Poxvirus-Infektion zu zerlegen, haben wir einen in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Test entwickelt. Dieser Reporter-Test besteht aus vier Kernschritten: (1) PCR zur Verstärkung der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung von mRNA mit T7-RNA Polymerase; (3) Transfection zur Einführung in vitro transkribierte mRNA in Zellen; (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung. Der hier beschriebene RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test umgeht Probleme der Plasmid-Replikation in poxvirusinfizierten Zellen und kryptischer Transkription aus dem Plasmid. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente in einer mRNA zu bestimmen, einschließlich 5 ‘-UTR und 3 ‘-UTR in anderen Systemen als poxvirus-infizierten Zellen. Darüber hinaus können mit dieser Methode verschiedene Arten der Übersetzungsinitiation wie kappenabhängig, kappenunabhängig, Wiederinitiation und interne Initiation untersucht werden.

Introduction

Nach dem zentralen Dogma fließt genetische Information von der DNA zur RNAund schließlich zudem Protein 1,2. Dieser Fluss von genetischen Informationen ist auf vielen Ebenen stark reguliert, einschließlich der mRNA-Übersetzung3,4. Die Entwicklung von Reporteranalysen zur Messung der Regulierung der Genexpression wird das Verständnis der in diesem Prozess involvierten Regulierungsmechanismen erleichtern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der mRNA-Übersetzung mit einem in vitro transkribierten RNA-basierten Luciferase-Reporter-Test in poxvirus-infizierten Zellen.

Poxviren umfassen viele hochgefährliche menschliche und tierische Krankheitserreger 5. Wie alle anderen Viren setzen Poxviren bei der Proteinsynthese6,7,8ausschließlich auf Wirtszell-Maschinen. Um virale Proteine effizient zu synthetisieren, entwickelten Viren viele Strategien, um zelluläre Übersetzungsmaschinen zu entführen, um sie für die Übersetzung von viralen mRNAs7,8umzuleiten. Ein häufig von Viren verwendeteter Mechanismus ist es, cis-wirkende Elemente in ihren Transkripten zu verwenden. Bemerkenswerte Beispiele sind die interne Ribosome Entry Site (IRES) und cap-independent translation enhancer (CITE)9,10,11. Diese cis-Elementemachen die viralen Transkripte zu einem translationalen Vorteil, indem sie translationale Maschinenüberverschiedene Mechanismen 12, 13,14anziehen. Mehr als 100 poxvirus mRNAs haben ein evolutionär konserviertes cis-wirkendes Element in der 5 ‘-unübersetzten Region (5 ‘-UTR): Ein 5 ‘-Poly (A) Führer (A) an den ganz 5 ‘ Enden dieser mRNAs15,16. Die Längen dieser 5 ‘-poly (A)-Führer sind heterogen und werden durch das Verrutschen der poxviruskodierten RNA-Polymerase während der Transkription17,18erzeugt. Wir und andere haben vor kurzem herausgefunden, dass der 5 ‘-poly (A)-Führer einem mRNA in Zellen, die mit dem Impfinien-Virus (VACV) infiziert sind, einen Übersetzungsvorteil verleiht, demprototypischen Mitglied von Poxviren 19,20.

Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test wurde ursprünglich entwickelt,umdie Rolle des 5 ‘-poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung währendder Poxvirus-Infektion 19,21zuverstehen. Obwohl Plasmid-DNA-basierte Lluciferase-Reporter-Assays weit verbreitet sind, gibt es mehrere Nachteile, die die Ergebnisinterpretation in poxvirus-infizierten Zellen erschweren. Zunächst können Plasmide in VACV-infizierten Zellen 22 vermehren. Zweitens kommt die kryptische Transkription häufig von Plasmid-DNA18,23, 24. Drittens erzeugt VACV-Promoter-getriebene Transkription Poly (A)-Führer heterogener Längen, was es schwierig macht, die Poly-(A)-Anleiterlänge in einigen Experimenten 18 zu kontrollieren. Ein in vitro transkribierter RNA-basierter Luciferase-Reporter-Test umgeht diese Probleme und die Dateninterpretation ist einfach.

Es gibt vier Schlüsselschritte in dieser Methode: (1) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription zu erzeugen; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA; (3) Transfektion zur Lieferung mRNA in Zellen; Und (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung (Abbildung1). Das daraus resultierende PCR-Amplizium enthält folgende Elemente in 5 ‘ bis 3 ‘ Richtung: T7-Promoter, Poly (A) Leader oder gewünschte 5 ‘-UTR-Sequenz, firefly luciferase open reading frame (ORF), gefolgt von einem Poly (A) Schwanz. PCR-Ampliver wird als Vorlage verwendet, um mRNA durch In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase zu synthetisieren. Bei der In-vitro-Transkriptionwird m 7 G-Kappe oder andere Kappenanaloge in neu synthetisierte mRNA integriert. Die gekappten Transkripte werden in nicht infizierte oder VACV-infizierte Zellen transferiert. Das Zelllysat wird zum gewünschten Zeitpunkt nach der Transfektion gesammelt, um die Aktivitäten der Luciferase zu messen, die auf die Proteinproduktion aus der transfektiven mRNA hinweisen. Dieser Reporter-Test kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-element zu untersuchen, das in 5 ‘-UTR, 3 ‘-UTR oder anderen Regionen einer mRNA vorhanden ist. Darüber hinaus kann der in vitro transkribierte RNA-basierte Test verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der Übersetzungsinitiation zu untersuchen, einschließlich kap-abhängiger Initiation, kap-unabhängiger Initiation, Wiederinitiation und interner Initiation wie IRES.

Protocol

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR für In-Vitro-Transkription Zur Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR, Design-Primer. Bei der Konstruktion von Primern beachten Sie entscheidende Eigenschaften wie Primerlänge, Glühtemperatur (Tm), GC-Gehalt, 3 ‘ Ende mit G oder C etc.NOTE: In dieser Literatur 25,26,27ausführlich diskutiert. Design-Primer zur Gener…

Representative Results

Die vier Schritte des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Anenstehens: PCR zur Erzeugung von DNA-Schablonen für In-vitro-Transkription, In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA, mRNA-Transfektion und Luciferase-Messung, sind im schematischen Diagramm zu sehen ( Abbildung 1). Die Entwarf von Primern sowohl für DNA-Vorlagen (Fluc und Rluc) als auch für das allgemeine Schema der Überhangverlängerung PCR…

Discussion

Alle Vierkernschritte sind entscheidend für den Erfolg des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Sassay. Besonderes Augenmerk sollte auf das Grundierdesign gelegt werden, insbesondere für die T7-Promoter-Sequenz. Die Transkription von T7-RNA beginnt mit der Transkription des unterstrichenen ersten G (GGG-5 ‘-UTR-AUG-) im T7-Promoter, der vor der 5 ‘-UTR-Sequenz hinzugefügt wurde. Obwohl die Transkription Startplatz (TSS) beginnt von der ersten G am 5 ‘-Ende, sank die Zahl der G es weniger …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das Projekt wurde von den National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) an ZY und teilweise vom Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) in Form des Graduate Student Summer Stipend to PD gefördert.

Materials

2X-Q5 Master mix New England Biolabs M0492 High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog New England Biolabs S1411L Anti reverse Cap analog or ARCA
Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate Corning 3693 Opaque walled 96 well white plate with solid bottom
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1960 Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)
E.Z.N.A. Cycle Pure Kit OMEGA BIO-TEK D6492 PCR purification kit
GloMax Navigator Microplate Luminometer Promega GM2010 Referred as multimode plate reader luminometer
HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit New England Biolabs E2050S In-Vitro transcription kit
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668019 Cationic lipid transfection reagent
NanoDrop2000 Thermo Fisher Scientific ND-2000 Used to measure DNA and RNA concentration
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070 Reduced serum media
Purelink RNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific 12183018A RNA purification kit
Vaccinia Capping System New England Biolabs M2080 Capping system

Referenzen

  1. Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
  2. Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  3. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
  4. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
  5. Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. . Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , (2005).
  6. Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
  7. Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
  8. Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
  9. Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
  10. Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
  11. Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
  12. Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
  13. Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
  14. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
  15. Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
  16. Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
  17. Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
  18. Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
  19. Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
  20. Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
  21. Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
  22. De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
  23. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
  24. Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
  25. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  26. Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
  27. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , (2012).
  28. Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
  29. Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , 43-49 (2017).
  30. Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
  31. Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
  32. Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
  33. Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
  34. Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
  35. Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Dhungel, P., Cantu, F., Hernandez, C., Yang, Z. In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells. J. Vis. Exp. (147), e59626, doi:10.3791/59626 (2019).

View Video