Hier wird ein Protokoll zur effizienten CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelten Genbearbeitung in Säugetierzellen mittels Röhrenelektroporation vorgestellt.
Gen-E-Editing-Nukleasen, vertreten durch CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9), werden zu Mainstream-Werkzeugen in der biomedizinischen Forschung. Die erfolgreiche Lieferung von CRISPR/Cas9-Elementen in die Zielzellen durch Transfektion ist Voraussetzung für eine effiziente Genbearbeitung. Dieses Protokoll zeigt, dass die maschinelle Lieferung von CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) zusammen mit einsträngigen Oligodeoxynukleotid-Spendervorlagen (ssODN) an verschiedene Arten von Säugetierzellen zu robusten präzise Genbearbeitungsereignisse. Zunächst wurde TE angewendet, um CRISPR/Cas9 RNP und ssODNs zu liefern, um krankheitserregende Mutationen im Interleukin 2-Rezeptor-Subunit-Gamma (IL2RG)-Gen und Sepiapterin-Reduktase-Gen (SPR) in Kaninchen-Fibroblastenzellen zu induzieren. Genaue Mutationsraten von 3,57%-20% wurden erreicht, wie durch bakterielle TA-Klonsequenzierung bestimmt. Die gleiche Strategie wurde dann in menschlichen iPSCs auf mehreren klinisch relevanten Genen verwendet, einschließlich epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), Myosin-bindendes Protein C, Herz (Mybpc3) und Hämoglobin-Untereinheit Beta (HBB). Konsequent wurden hochpräzise Mutationsraten erreicht (11,65%-37,92%) durch tiefe Sequenzierung (DeepSeq) bestimmt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Röhrenelektroporation von CRISPR/Cas9 RNP ein effizientes Transfektionsprotokoll für die Genbearbeitung in Säugetierzellen darstellt.
CRISPR/Cas9 ist die am häufigsten verwendete programmierbare Nuklease für die Genbearbeitung. Es funktioniert durch Single Guide RNA (sgRNA)-vermittelte Erkennung beider Zielsequenzen und einer angrenzenden protospacer benachbarten Motivsequenz (PAM) im Genom. Die Cas9-Nuklease erzeugt einen doppelsträngigen DNA-Bruch (DSB), der drei Nukleotide vor der PAM-Sequenz1lokalisiert. Die DSBs werden entweder durch fehleranfällige nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparaturwege (HDR) repariert. Um eine präzise Genbearbeitung über den HDR-Signalweg zu erreichen, werden Spendervorlagen oft im Format plasmid-DNA (pDNA) oder einsträngigen Oligodeoxynukleotid (ssODN) bereitgestellt.
CRISPR/Cas9 und die sgRNA können in drei Formaten an die Zellen abgegeben werden: den Ribonukleoprotein (RNP) Komplex von Cas9-Protein und gRNA2,3; Cas9 mRNA und sgRNA4,5; oder Plasmid-DNA (pDNA), die die notwendigen Promotoren, angetriebene sgRNA und Cas9-Codierungsbereich6,7,8enthält. Viele Gruppen haben gezeigt, dass, wenn CRISPR/Cas9 als RNP geliefert wird, die Gen-Editing-Effizienz oft besser als die in pDNA- oder mRNA-Formaten erreichten, was auf die viel geringere Größe von RNP im Vergleich zu den Nukleinsäuren9zurückzuführen ist. Darüber hinaus hat sich bereits gezeigt, dass eine neuartige Röhrenelektroporation (TE) in Genbearbeitungsanwendungen in verschiedenen Zelltypen9besonders effektiv ist.
In der vorliegenden Arbeit wird ein schrittweises Protokoll zur Verwendung von TE für die Lieferung von CRISPR/Cas9 RNP an Säugetierzellen verschiedener Arten an mehreren klinisch relevanten Loci vorgestellt. Diese neuartige TE-Transfektionstechnik und das Phänomen der hohen HDR-Rate können breite Anwendungen in der biomedizinischen Forschung finden.
Die Tubeelektroporation Methode war wirksam bei der Bereitstellung von CRISPR/Cas9 RNP und ssODNs an Kaninchen und menschliche Zellen, was zu einer robusten präzisen Genbearbeitung (PGE) führte. Der Hauptunterschied zwischen TE und anderen konventionellen Elektroporationsgeräten ist die Verwendung eines Rohres, in dem sich zwei Elektroden oben und unten des Rohres befinden und die Probe vollständig geladen und bei Elektroporation versiegelt wird (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu befinden sich in einer konventionellen Küvette die Elektroden an den Seiten und die Probe wird während der Elektroporation nicht vollständig abgedichtet. Dieses neue Design reduziert die Erzeugung von Luftblasen und komprimiert die Luftblasengröße, was die gleichmäßige Verteilung der elektrischen Spannung verbessert und dadurch zu einem reduzierten Zelltod und einer hohen Transfektionseffizienz9führt. In der vorliegenden Arbeit sind hohe PGE-Raten (15%-37%) EGFR-, Mybpc3- und HBB-Gene in humanen iPSCs erreicht wurden. Diese Ergebnisse stimmen mit einem früheren Bericht überein, in dem hohe PGE-Raten in menschlichen Stammzellen erreicht wurden9.
Krankheitserregende Mutationen wurden in IL2RG- und SPR-Genen in Kaninchenzellen gezielt. Kürzlich wurden IL2RG-Knockout-Kaninchen als Modelle für menschliche X-verknüpfte schwere kombinierte Immunschwäche (SCID-X1)16,17produziert. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Il2RG-Mutationen des Patienten (z. B. C231Y und Q235X) effizient in Kaninchenzellen erzeugt werden können, was die Machbarkeit der Erstellung von SCID-X1-Kaninchenmodellen mit Patientenmutationen demonstriert. Es wurde auch gezeigt, dass SPR R150G Mutationen effizient in Kaninchenzellen erzeugt werden können. Diese Mutation verursacht motorische und kognitive Defizite bei Kindern12. Diese EINMAL erzeugten IL2RG- und SPR-Mutationskaninchenmodelle können als wertvolle präklinische Modelle für translationale Studien dienen. Sie können auch verwendet werden, um Gen-Editing-basierte Therapeutika für diese monogenen Krankheiten zu etablieren.
Ein Anliegen von CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Editing-Anwendungen sind die Off-Target-Bearbeitungsereignisse. Die Indelraten wurden an vorhergesagten Top-Off-Target-Standorten für sgRNAs analysiert, die in dieser Studie verwendet wurden (Tabelle S1), mit Methoden, die zuvor beschrieben wurden9. Insgesamt wurden sieben potenzielle Top-Off-Target-Loci für sg-rb-IL2RG-01, fünf für sg-rb-SPR, sieben für sg-hEGFR, fünf für sg-hMybpc3 und sieben für sg-hHBB) mit den in Tabelle S2aufgeführten Primern analysiert. Die T7E1-Assays (Abbildung S1), die auf minimale Off-Target-Risiken für die CRISPR/Cas9-vermittelte Genbearbeitung mit diesen sgRNAs hindeuten, zeigten keine Off-Target-Indels an. Es zeigt auch an, dass die TubeElektroporation-Methode selbst keine Off-Target-Bearbeitungen verursacht oder erhöht. Dennoch sollten Anstrengungen unternommen werden, um unerwünschte Off-Target-Bearbeitungen zu reduzieren oder zu beseitigen. Eine Sequenzierung des ganzen Genoms kann erforderlich sein, um solche Ereignisse für Zellen auszuschließen, die für die Verwendung in klinischen Anwendungen bestimmt sind.
Auf technischer Ebene werden die folgenden Schlüsselfaktoren für eine effiziente präzise Genombearbeitung durch CRISPR/Cas9 RNP-Röhrenelektroporation betrachtet. Zunächst wird empfohlen, eine effiziente sgRNA mit vorhergesagtem niedrigen Off-Target-Potenzial auszuwählen. Es ist wichtig, die Indel-Effizienz der ausgewählten sgRNA zu validieren, bevor sie für PEG-Anwendungen verwendet wird. Es ist nicht selten, dass eine Software, die eine gute sgRNA vorhergesagt hat, beim Validierungsschritt fehlschlägt.
Zweitens wird empfohlen, dem ssODN-Spender nach Möglichkeit eine PAM-Mutation zu induzieren, um eine hohe PGE zu erreichen. Der Grund dafür ist, dass dadurch crispR/Cas9 nach der Integration von Spendervorlagen erneut geschnitten wird. In bestimmten Fällen führt die PGE selbst PAM-Mutationen ein. In anderen Fällen ist es möglich, stille Mutationen in die PAM-Sequenz einzuführen. Für den Fall, dass eine PAM-Mutation nicht möglich ist, wird empfohlen, mehrere stille Mutationen in den Spender aufzunehmen, die der sgRNA-Sequenz entsprechen.
Drittens, besonders relevant für TE, ist es wichtig, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, wenn Zellen und RNP-Gemisch auf das Elektroporationsrohr übertragen werden. Während das Design eines TE-Rohrs bereits die Luftblasenbildung minimiert, wird eine sorgfältige Handhabung die Bildung von Luftblasen weiter reduzieren und sogar die Luftblasenbildung vollständig vermeiden. Eine Anleitung zur Fehlerbehebung für häufige Probleme, die bei der Anwendung der Rohrelektroporation für CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein vermittelte präzise Genbearbeitung auftreten können, ist in Tabelle 2aufgeführt.
Zusammenfassend lässt sich hier zeigen, dass die Röhrenelektroporation ein wirksames Mittel zur Abgabe von CRISPR/Cas9 RNP und ssODNs an Säugetierzellen ist, um hohe PGE-Raten zu erreichen. Diese neue TE-Transfektionstechnik und ihre robuste präzise Gen-Editing-Rate können die Entwicklung von Gen-Editing-Anwendungen erleichtern.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R21OD023194 bis JX) unterstützt. Diese Arbeit nutzte Core Services, die vom Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics (CAMTraST) am University of Michigan Medical Center unterstützt wurden.
Accutase | STEMCELL Technologies | 792 | Cell detachment solution for human iPSCs, first used in Step 1.1.2. |
Cas9 Nuclease 3NLS | IDT | 1074182 | Cas9 protein, first used in Step 3.3. |
DMEM | Thermo Fisher | 11965092 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
DPBS | Thermo Fisher | 1708075 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
EDTA | Lonza | 51201 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Electroporation buffer | Celetrix | 13–0104 | The electroporation buffer, first used in Step 3.2. |
Electroporation tubes | Celetrix | 20 μL: 12–0107; 120 μL: 12–0104 | The electroporation tube, first used in Step 3.4. |
Electroporator | Celetrix | CTX-1500A LE | The tube electroporation machine, first used in Step 3.5 |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Forma CO2 Incubators | Thermo Fisher | Model 370 | For cell culture, first used in Step 1.1. |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28115 | For gel purification, first used in Step 4.3. |
Human induced pluripotent stem cells | American Type Culture Collection | ACS-1030 | Human iPSCs, first used in Step 1.1. |
Matrigel | Corning | 354277 | Artificial extracellular matrix; for precoating cell culture plate, first used in Step 1.1. |
mTeSR 1 medium | STEMCELL Technologies | 85850 | Feeder-free cell culture medium for human iPSCs, first used in Step 1.1. |
PCR SV mini | GeneAll | 103-102 | For PCR product purification, first used in Step 4.3. |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | For preparing cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Phenol-chloroform | Thermo Fisher | 15593031 | For DNA extraction, first used in Step 4.2. |
Precision gRNA Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For the generation of full length gRNA (guide RNA), first used in Step 2.4. |
Proteinase K Solution | Thermo Fisher | AM2548 | For DNA extraction, first used in Step 4.1. |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification, first used in Step 4.3. |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
TA Cloning Kit | Thermo Fisher | K457502 | For TA clone sequencing, first used in Step 4.4. |
Tissue Culture Dish (10 cm) | FALCON | 353003 | For cell culture, first used in Step 1.2.3. |
Tissue Culture Dish (12 well) | FALCON | 353043 | For cell culture, first used in Step 3.7. |
Tissue Culture Dish (6 cm) | FALCON | 353004 | For cell culture, first used in Step 1.2.2. |
Tris HCl | Thermo Fisher | BP1757-500 | For making lysis buffer, first used in Step 4.1. |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 | For cell digestion, first used in Step 1.2. 4. |
Universal Fit Pipette Tips | Celetrix | 14-0101 | For electroporation, first used in Step 3.4. |
Y27632 | LC Labs | Y-5301 | The apoptosis inhibotor, first used in Step 1.1.1. |