Multipel sklerose er en inflammatorisk demyelinerende sygdom uden helbredelse. Analyse af hjernevæv giver vigtige fingerpeg til at forstå patogenesen af sygdommen. Her diskuterer vi den metode og downstream analyse af MS Brain tissue indsamlet gennem en unik Rapid obduktion program i drift på Cleveland Clinic.
Vi beskriver en hurtig vævs donation program for personer med multipel sklerose (MS), der kræver videnskabsfolk og teknikere til at være on-Call 24/7, 365 dage om året. Deltagerne giver deres samtykke til at donere deres hjerne og rygmarv. De fleste patienter blev efterfulgt af neurologer på Cleveland Clinic mellen Center for MS behandling og forskning. Deres kliniske kurser og neurologiske handicap er velkarakteriserede. Kort efter døden transporteres kroppen til MS Imaging Center, hvor hjernen scannes in situ med 3 T magnetisk resonans imaging (MRI). Kroppen overføres derefter til obduktions rummet, hvor hjernen og rygmarven fjernes. Hjernen er opdelt i to halvkugler. En halvkugle er straks placeret i en udskæring boks og suppleant 1 cm-tykke skiver er enten fastgjort i 4% PARAFORMALDEHYD i to dage eller hurtigt frosset i tøris og 2-methylbutan. De kort faste hjerne skiver lagres i en kryopreserverings opløsning og anvendes til histologiske analyser og immunocytochemical påvisning af følsomme antigener. Frosne skiver opbevares ved-80 °C og anvendes til molekylære, immunocytokemiske og in situ-hybridiserings-/RNA-Scope-studier. Den anden halvkugle er placeret i 4% PARAFORMALDEHYD i flere måneder, placeret i udskæring boks, genscannet i 3 T magnetisk resonans (MR) scanner og skåret i centimeter-tykke skiver. Postmortem in situ MR images (MRIs) er co-registreret med 1 cm-tykke hjerne skiver for at lette MRI-patologi korrelationer. Alle hjerne skiver er fotograferet og hjerne hvide stof læsioner identificeres. Rygmarven skæres i 2 cm segmenter. Alternative segmenter er fastgjort i 4% PARAFORMALDEHYD eller hurtigt frosset. De hurtige indkøb af postmortem væv giver mulighed for patologiske og molekylære analyser af MS hjerner og rygmarv og patologiske korrelationer af hjernen MRI abnormiteter. Kvaliteten af disse hurtigt forarbejdede postmortem-væv (normalt inden for 6 timer af døden) er af stor værdi for MS Research og har resulteret i mange high-impact opdagelser.
En af de bedste måder at studere en sygdom på er at undersøge det sygdomsramte væv selv. Dette præsenterer udfordringer for dem, der studerer sygdomme i centralnervesystemet (CNS). Biopsier af syge hjerne og rygmarv er ekstremt sjældne og involverer normalt atypiske tilfælde. Obduktions rater for personer med CNS-sygdomme er faldet dramatisk i de seneste år, og når de udføres, de ofte ikke giver hurtig udtagning af væv. Disse udfordringer har resulteret i etableringen af sygdoms centrerede hjerne banker, herunder flere fokuseret på indsamling af væv fra personer med multipel sklerose (MS). MS er en inflammatorisk-medieret sygdom i CNS, der ødelægger myelin, oligodendrocytter (myelin danner celler), neuroner, og axons. De fleste MS patienter har en bi-phasic sygdom kursus, der starter med anfald af neurologiske handicap med variabel opsving, der i sidste ende udvikler sig til en gradvist progressiv sygdom, der er sandsynligt neurodegenerative i naturen1. For størstedelen af doneret MS hjerner, post mortem intervaller (PMI) mellem død og vævs behandling overstiger 24 h. Mens disse væv har givet værdifulde oplysninger om patologiske ændringer i MS hjerner, de er ikke egnet til mere avancerede molekylære undersøgelser, der kan give en effektiv indsigt i sygdoms patofysiologi. Dette er især tilfældet for genprofilering undersøgelser, som kræver intakt RNA.
For at overvinde begrænsningerne diskuteret ovenfor, har vi udviklet en hurtig vævs donation program, der giver mulighed for MRI/patologiske korrelationer. Denne protokol giver velbevarede væv egnet til moderne molekylære undersøgelser og giver mulighed for direkte sammenligning af hjernens patologi og MRI abnormaliteter i MS hjerner. Cleveland Clinic multipel sklerose vævs donation program har eksisteret i over 20 år. Denne hurtige vævs donation program indkøber hjerner og rygmarv fra personer med MS og andre tilknyttede autoimmune neurologiske tilstande. Programmet har til formål at opnå in situ MRIs inden 6 h af døden, efterfulgt af fjernelse af hjernen og rygmarven til vævs behandling.
Rekruttering
Donationer opnås enten gennem præ-mortem-samtykke, der er indhentet direkte fra patienter (forhåndsgodkendt) eller fra pårørende efter døden. Præ-samtykkede patienter er typisk identificeret fra den kliniske population på mellen Center for multipel sklerose behandling og forskning i Cleveland, Ohio. Selv om præference i rekruttering i Rapid tissue donation program gives til patienter, der er blevet fulgt i longitudinale forskningsundersøgelser, det er åbent for alle patienter set i midten. Deltagere, der tilmelder sig før døden, får instrukser til familiemedlemmer eller omsorgs udbydere om at kontakte forskerholdet, enten på dødstidspunktet, eller når døden menes at være overhængende. Den anden metode for enkeltpersoner at komme ind i vævs donation program er på tidspunktet for døden gennem samtykke fra pårørende. Staten Ohio kræver dødsfald for at blive henvist til en føderalt bemyndiget organ indkøbsorganisation ved navnet LifeBanc, som opererer i 20 amter i det nordøstlige Ohio. LifeBanc skærme alle dødsfald for en diagnose af MS, som er en udelukkelse for organdonation. Der blev indført ordninger for LifeBanc til at underrette efterforskere fra MS tissue donation program for alle dødsfald med en tilhørende diagnose af MS forekommer inden for en 75-mile radius fra Cleveland Clinic. Næste af pårørende og hospitalspersonale bliver derefter kontaktet af vævs donation program personale og samtykke er opnået for donation af hjernen og rygmarven væv. Disse to metoder til rekruttering før og efter slagtning gennem LifeBanc resulterer i ca. 10-12 hjerne donationer pr. år. Der foretages justeringer af den øvre aldersgrænse for dødsfald for at styre antallet af henvisninger fra LifeBanc.
Indkøb af donationer
Programmet kræver 24 h dækning, 365 dage om året af medlemmer af vævs donation program for væv indkøb. En centraliseret vævs donation Notification e-mail/pager/mobil enhed tekstbesked system bruges af det kliniske team, der dækker vævsdonationer. LifeBanc er leveret numre til at kontakte On-Call personale til vævs donation program. Medlemmer underrettes om dødsfald af hospitals udbydere/pårørende (forhåndsgodkendte) eller af LifeBanc og andre henvisningskilder. For det første er der en bestemmelse af dødstidspunktet og gennemførligheden af vævs donation. Dødsfald screenes derefter for forhold, der potentielt kan resultere i væv af dårlig kvalitet, herunder forlænget præ-mortem-hypoksi, massiv destruktiv hjernevæv (f. eks. stor intrakraniel blødning, omfattende bi-hemispheriske slagtilfælde, omfattende tumor forlænget respirations støtte (> 3 dage) og langvarig brug af vasoaktive stoffer (> 3 dage) før døden. Når en medicinsk eksaminator er involveret i en død, kan undersøgelsen neurolog tale med den medicinske eksaminator til at udforske en måde at modtage rettidig væv uden at kompromittere den medicinske eksaminator ansvar. Hvis levedygtige væv mærkes at være til stede, derefter skriftligt samtykke er opnået (hvis ikke opnået præ-mortem) og præparater er lavet til krops transport. En tidligere kontraheret afdøde transport service er derefter kontaktet for transport til MRI faciliteter på Cleveland Clinic. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at kroppen forbliver ved stuetemperatur og ikke anbringes i køleanlæg, da lavere krops temperaturer er forbundet med ændringer i MRI-signal egenskaberne.
Kliniske historie
Kliniske historie omfatter oplysninger om diagnosticering af MS, debut af symptomer, behandlinger, der anvendes, resultater af kliniske og para-kliniske test (fremkaldt potentialer, cerebrospinalvæske resultater, optisk kohærens tomografi), multipel sklerose funktionelle komposit , og udvidet handicapstatus skala (EDSS, faktiske eller anslåede), som er indsamlet fra den medicinske Journal (hvor tilgængelig), og direkte interview af pårørende. Der indsamles også præ-mortem-MRI.
Vi beskriver en protokol, der er blevet brugt til hurtigt at skaffe og bearbejde væv fra over 150 personer med MS. Et vigtigt træk ved denne protokol er, at forskerne, der udnytter vævet, også er ansvarlige for at etablere protokollen og udføre vævs samlingen. Dette giver fleksibilitet til at opfylde de videnskabelige behov i de enkelte forskningsprojekter. Flere aspekter af denne protokol forbedre dens nytte. Patienterne er normalt velkarakteriserede før døden, da mange af dem er blevet efterfulgt af neurologer i vores Center. Et kritisk skridt er behandlingen af vævsdonationer kort efter døden, hvilket øger kvaliteten af det frosne væv i forhold til nogle andre hjerne banker. Dette muliggør molekylære undersøgelser, der er af stor værdi for at beskrive ændringer i transkriptionelle og translationelle genprodukter, som er væsentlige for dokumentation af histologiske og immunocytokemiske observationer. Gearing af morfologiske/immunocytokemiske og molekylære data på tværs af flere tilfælde øger pålideligheden af konklusioner. Dette illustreres bedst af vores beskrivelse af mitokondrie gen ændringer i hjernebarken og neuronal gen ændringer i demyelineret hippocampi. Nye genprofilerings protokoller udvikles hurtigt, og det frosne væv i vores bank bør give høj kvalitet RNA til vævs-og enkelt celle analyse.
Et andet værdsat aspekt af vores protokol er de kort faste hjerne skiver. Disse væv er skåret i 30 μm-tykke, fritflydende sektioner. Disse sektioner er ideelle til brug af Konfokal mikroskopi til at analysere to eller flere antigener i tre dimensioner. Gode eksempler omfatter samspillet mellem præ-myelinating oligodendrocyte processer med dystrofisk axoner i kroniske MS-læsioner, samt identifikation af enkelt-axonal forbindelser til transected axonal tilbagetrækning pærer. Dette er i modsætning til rutinemæssig brug af 7 μm-tykke paraffin sektioner, hvor 3D-billeder ikke er gennemførlige. Paraffin-indlejret væv har stor værdi for nogle spørgsmål, især kvantificering af neuronal tætheer i hemisfærisk 7 μm-tykke sektioner. Vores vævs forarbejdnings protokoller er derfor forskellige og giver fleksibilitet til at sikre faste og hurtigt frosne væv.
Et andet unikt træk ved vores protokol er den postmortem in situ-hjerne-MRI. Hjernen MRIs er en uerstattelig biomarkør af MS disease. Det er derfor vigtigt at etablere de patologiske korrelater af unormale MRI-signaler. Vores undersøgelser har påvist, at både T2 og T2T1MTR ROIs ofte er myelinerede. Dette fund understøtter behovet for mere specifikke billedbehandlings metoder, der pålideligt skelner mellem myelineret og demyelineret cerebral hvidt stof. MRI synes at være følsom for påvisning af myelin, men vores undersøgelser viser, at selv en kombination af T1/T2/MTR ikke er specifik for at identificere myelination. Vores post mortem-protokol giver en ideel platform til afprøvning af muligheden for nye billedbehandlings metoder til at skelne mellem myelineret og demyelineret cerebral hvidt stof. MRI giver også det ideelle køretøj til oversættelse af grundlæggende videnskabelige resultater til klinisk praksis, i betragtning af brugen af MRI i vores Translationel forskning og dens udbredte kliniske brug i levende patienter.
Mens skære kort-og lang-fast samt frosne skiver giver en fordel for behandling af væv i flere tilstande for forskellige undersøgelser, der er nogle begrænsninger med denne metode. En vurdering af hele en struktur kan være begrænset, da dele af den kan behandles forskelligt på tilstødende skiver. Den store mængde af vævs banken, dog, giver mulighed for at undersøge en struktur af interesse i flere til at forbedre prøvetagning. En anden generel begrænsning af undersøgelser, der udnytter postmortem væv, er, at de er tværsnits. Konklusioner vedrørende timing og progression af ændringer skal fortolkes i denne sammenhæng. Der kan være en udvælgelse bias til patienter, der donere deres væv, som kan begrænse generalisering af data til alle patienter med MS. Da de fleste donorer dør af komplikationer af avancerede MS, kan det ikke være hensigtsmæssigt at ekstrapolere fund fra disse patienter til dem i tidligere stadier af MS. Ikke desto mindre har vi modtaget væv fra yngre patienter, der døde af ikke-MS-relaterede sygdomme (dvs. akut myokardieinfarkt, overdosering af lægemidler, selvmord). Anvendelsesområdet for vores protokol omfatter ikke prøvetagning af andre organer (f. eks. gastrointestinal og knoglemarv), som har været impliceret i MS. Vi mener, at styrkerne i programmet i høj grad opvejer dets begrænsninger.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil også gerne takke Dr. Christopher Nelson for redaktionel assistance. Obduktions programmet understøttes delvis af R35 Grant NS097303 til BDT. Arbejdet i RD-laboratoriet understøttes af tilskud fra NINDS (NS096148) og det nationale multipel sklerose Society, USA (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |