טרשת נפוצה היא מחלה. בלתי מיאלואידית דלקתית ללא מרפא ניתוח רקמת המוח מספק רמזים חשובים כדי להבין את הפתוגנזה של המחלה. כאן אנו דנים מתודולוגיה וניתוח במורד הזרם של רקמת המוח של MS שנאספו באמצעות תוכנית מהירה ניתוח מהיר ייחודי במבצע במרפאת קליבלנד.
אנו מתארים תוכנית תרומת רקמה מהירה עבור אנשים עם טרשת נפוצה (MS) כי דורש מדענים וטכנאים להיות על-שיחה 24/7, 365 ימים בשנה. המשתתפים מסכימים לתרום את המוח שלהם ואת חוט השדרה. רוב המטופלים עקבו אחר הנוירולוגים במרכז הרפואי של קליבלנד קליניק לטיפול ולמחקר של MS. הקורסים הקליניים שלהם והלקויות הנוירולוגיות מאופיינים היטב. זמן קצר לאחר המוות, הגוף מועבר אל מרכז הדמיה MS, שבו המוח נסרק באתרו על ידי 3 T תהודה מגנטית דימות (MRI). הגוף מועבר לחדר הנתיחה שלאחר המוות, שם מוסרים המוח וחוט השדרה. המוח מחולק לשתי אונות. האונה האחת מונחת מיד בתיבת חיתוך ופרוסות 1 ס מ בעובי של לסירוגין הם קבועים 4% פאראפורמלדהיד במשך יומיים או קפוא במהירות בקרח יבש ו 2-מתילבוטאן. פרוסות המוח קצר קבוע מאוחסנים בתמיסה הקפאה ומשמש ניתוח היסטולוגית וזיהוי האימונוציטוטוכימיה של אנטיגנים רגישים. פרוסות קפואות מאוחסנות ב-80 ° c ומשמשות עבור מולקולרית, אימונוציטוטוכימיה, ובחקר טווח היברידיזציה/רנ א באתרו. חצי הכדור השני ממוקם 4% פאראפורמלדהיד במשך מספר חודשים, ממוקם בתיבת הפרוסות, נסרק מחדש ב 3 T תהודה מגנטית (MR) סורק ופרוסות לתוך סנטימטר-חתיכות עבות. לאחר המוות באתרו תמונות MR (MRIs) הם שיתוף הרשום עם פרוסות המוח 1 ס מ כדי להקל על היחסים של MRI-פתולוגיה. כל פרוסות המוח מצולמות ונגעים במוח הלבן מזוהים. חוט השדרה נחתך למקטעים של 2 ס מ. מקטעים חלופיים הם קבועים 4% פאראפורמלדהיד או קפוא במהירות. הרכש המהיר של רקמות MS שלאחר המוות מאפשר ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים של מוחות ומיתרי השדרה של MS ויחסי שדרה פתולוגית של מומים MRI המוח. האיכות של אלה מעובד במהירות רקמות שלאחר המוות (בדרך כלל בתוך 6 h של מוות) הוא בעל ערך רב למחקר MS והביא תגליות רבות השפעה גבוהה.
אחת הדרכים הטובות ביותר לחקר מחלה היא לבחון את הרקמה החולה עצמה. זה מציג אתגרים לאלה הלומדים מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CN). ביופסיות של המוח החולה וחוט השדרה הם נדירים מאוד ובדרך כלל כרוכים במקרים חריגים. שיעורי הנתיחה שלאחר המוות עבור אנשים עם מחלות האבל ירדו באופן דרמטי בשנים האחרונות, וכאשר מבוצע, הם לעתים קרובות לא מספקים רכש מהיר של רקמות. אתגרים אלה הביאו להקמת בנקים מבוססי מחלות במוח, כולל מספר התמקדו באיסוף רקמות מאנשים עם טרשת נפוצה (MS). MS היא מחלה דלקתית בתיווך של ה-CN שהורס המיאלין, oligodendrocytes הפוך (תאים ויוצרים המיאלין), נוירונים, ו axons. רוב המטופלים MS יש קורס bi-phasic מחלה המתחיל עם התקפי נכות נוירולוגית עם התאוששות משתנה, כי בסופו של דבר מתפתחת לתוך מחלה מתקדמת בהדרגה, כי הוא סביר נוירוניווניות בטבע1. עבור רוב מוחות MS שנתרמו, מרווחי לאחר המוות (PMI) בין מוות עיבוד רקמות עולה 24 h. בעוד רקמות אלה סיפקו מידע חשוב על שינויים פתולוגיים במוח MS, הם לא מתאימים למחקרים מולקולריים מתקדמים יותר שיכולים לספק תובנות חזקות לתוך פתופסולוגיה המחלה. זה במיוחד המקרה עבור מחקרים גנים הפרופילים, אשר דורשים RNA שלם.
כדי להתגבר על המגבלות שנדונו לעיל, פיתחנו תוכנית תרומת רקמות מהירה המאפשרת לקשרי MRI/פתולוגיים. פרוטוקול זה מספק רקמות שהשתמרו היטב מתאים למחקרים מולקולאריים מודרניים ומאפשר השוואה ישירה של מחלות מוח ומומים MRI ב-MS המוחות. המרפאה בקליבלנד טרשת נפוצה רקמת התרומה התוכנית כבר בקיום מעל 20 שנים. זו התוכנית תרומת רקמה מהירה רכש את המוח ואת חוטי השדרה מאנשים עם MS ואחרים הקשורים בתנאים נוירולוגיים אוטואימוניות. התוכנית שואפת להשיג באתרו MRIs בתוך 6 h של מוות, ואחריו הסרת המוח חוט השדרה לעיבוד רקמות.
גיוס
תרומות מתקבלות באמצעות הסכמה לאחר המוות שהתקבל ישירות מחולים (מוכנות מראש) או מקרובי משפחה לאחר המוות. חולים טרום הסכימו מזוהים בדרך כלל מן האוכלוסייה הקלינית במרכז Mellen לטיפול טרשת נפוצה ומחקר בקליבלנד, אוהיו. למרות העדפה בגיוס בתוכנית תרומת רקמה מהירה ניתנת לחולים שבאו בעקבות לימודי האורך, הוא פתוח לכל המטופלים שנראו במרכז. משתתפים שנרשמים לפני המוות מקבלים הוראות לבני משפחה או לנותני טיפול ליצור קשר עם צוות המחקר, בזמן המוות או כאשר המוות נחשב לקרוב. השיטה השנייה להיכנס לתוכנית תרומת הרקמה היא בזמן המוות באמצעות הסכמה של קרובי משפחה. מדינת אוהיו דורש מקרי מוות להתייחס לארגון רכש הנהוגה על ידי האיברים המנדט הפדרלי בשם LifeBanc, אשר פועל 20 מחוזות של צפון מזרח אוהיו. LifeBanc מסכי כל מקרי המוות עבור אבחנה של MS, שהיא הדרה עבור תרומת איברים. סידורים נעשו עבור LifeBanc להודיע לחוקרים מתוכנית התרומה לרקמות MS עבור כל מקרי המוות עם אבחנה משויכת של MS המתרחשים ברדיוס של 75 ק מ מהמרפאה בקליבלנד. קרובי משפחה וצוות בית החולים הם יצרו קשר על ידי צוות התוכנית תרומת רקמה והסכמה מתקבלת לתרומה של רקמות המוח וחוט השדרה. אלה שתי שיטות של גיוס לאחר המוות לאחר לאחר המוות באמצעות LifeBanc התוצאה היא כ 10-12 תרומות המוח בשנה. התאמות מבוצעו למגבלת הגיל העליון של המוות כדי לנהל את מספר ההפניות הנגזרות LifeBanc.
רכישת תרומות
התוכנית דורשת 24 שעות כיסוי, 365 ימים בשנה על ידי חברים בתוכנית תרומת רקמה לרכישת רקמות. מרכזי הודעה תרומת רקמה דוא ל/זימונית/טלפון נייד המכשיר מערכת משמש את הצוות הקליני כיסוי תרומות רקמות. LifeBanc מסופק מספרים כדי ליצור קשר עם צוות הקריאה עבור תוכנית תרומת רקמות. חברים מקבלים הודעה על מוות על ידי ספקי בית החולים/קרובי משפחה (טרום הסכימו) או על ידי LifeBanc ומקורות הפניה אחרים. ראשית, קביעת זמן מוות והיתכנות לתרומת רקמות נעשתה. מקרי המוות מוקרנים אז לתנאים שעלולים לגרום לרקמה באיכות ירודה, כולל היפוקסיה ממושכת שלפני המוות, רקמת מוח הרסנית מסיבית (למשל, דימום תוך-גולגולתי גדול, משיכות דו-מיזיות נרחבות, גידול נרחב נטל), תמיכה ממושכת במכונת ההנשמה (> 3 ימים) ושימוש ממושך בסוכני vasoactive (> 3 ימים) לפני המוות. כאשר בוחן רפואי מעורב במוות, נוירולוג המחקר יכול לדבר עם הבודק הרפואי לחקור דרך לקבל רקמות בזמן מבלי להתפשר על האחריות של הבוחן הרפואי. אם הרקמה בר קיימא הוא הרגיש להיות נוכח, אז הסכמה בכתב מתקבל (אם לא התקבל טרום לאחר המוות) וההכנות נעשים עבור תחבורה הגוף. לאחר מכן נוצר קשר עם שירות הסעות בשירות ההסעות הקודם למתקני MRI במרפאת קליבלנד. הטיפול נלקח כדי להבטיח כי הגוף נשאר בטמפרטורת החדר והוא לא ממוקם לתוך קירור, כמו טמפרטורות הגוף התחתון משויכים שינויים במאפייני האות MRI.
היסטוריה קלינית
ההיסטוריה הקלינית כוללת פרטים על האבחנה של MS, התפרצות של סימפטומים, טיפולים בשימוש, תוצאות של בדיקות קליני פרה קליני (מעורר פוטנציאל, התוצאות נוזל שדרתי, טומוגרפיה אופטית קוהרנטית), טרשת נפוצה פונקציונלי מרוכבים , ולהרחיב את היקף מצב הנכות (EDSS; בפועל או מוערך), אשר נאספים מהרשומה הרפואית (היכן שזמין), וראיון ישיר של קרובי משפחה. MRI מלפני המוות נאספים גם כן.
אנו מתארים פרוטוקול ששימש להשיג ולעבד במהירות רקמות מ 150 אנשים עם MS. תכונה חשובה של פרוטוקול זה היא כי המדענים לנצל את הרקמה הם גם אחראי על הקמת הפרוטוקול וביצוע אוסף הרקמה. הדבר מספק גמישות בעמידה בצרכים המדעיים של פרוייקטי מחקר בודדים. כמה היבטים של פרוטוקול זה לשפר את השירות שלה. המטופלים בדרך כלל מאופיינים היטב לפני המוות, כפי שרבים מהם הופעלו על ידי נוירולוגים במרכז שלנו. צעד קריטי הוא עיבוד תרומות רקמות זמן קצר לאחר המוות, אשר מגביר את איכות הרקמה הקפואה לעומת כמה בנקים מוח אחרים. הדבר מאפשר מחקרים מולקולריים בעלי ערך רב בתיאור שינויים במוצרי הגנים הטרנסג והטרנסלקליים, החיוניים למתן תצפיות היסטולוגיות ואימונוטוקוכימיקלים. מינוף של נתונים מורפולוגיים/אימונולוציקליים ומולקולריים על פני מספר מקרים מגביר את האמינות של המסקנות. זה מומחש הטוב ביותר על ידי התיאור שלנו של שינויי גנים מיטוכונדריאלי בקליפת מוחין ושינויי גנים עצביים בהיפוקמפוס מיאלואידית. הרומן פרופילים גנים מפותחים בקצב מהיר את הרקמה הקפואה בבנק שלנו צריך לספק RNA באיכות גבוהה עבור רקמות וניתוח תא בודד.
היבט מוערך נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא פרוסות המוח הקצרות והקבועות. רקמות אלה חותכים לתוך 30 μm-עבה, מקטעים צף חינם. סעיפים אלה אידיאליים לשימוש במיקרוסקופיה מיקרוקלית כדי לנתח שני אנטיגנים או יותר בשלושה מימדים. דוגמאות טובות כוללות את האינטראקציה של תהליכים אוליגודנדרוציטים טרום מיאלואידית עם אקסונים הדיסטרודים בנגעים MS כרונית, כמו גם זיהוי של חיבורי אקסונים בודד כדי להיות נורות הנסיגה אקסונים. זה בניגוד לשימוש שגרתי של 7 μm-עבה מקטעים פרפין, שבו תמונות 3D אינם ריאלי. פרפין-רקמות מוטבעות יש ערך רב עבור כמה שאלות, במיוחד את הקוונפיקציה של צפיפות עצבית במיספרה 7 μm-מקטעים עבים. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו לעיבוד רקמות מגוונים ומספקים גמישות כדי להבטיח רקמות קבועות וקפואות במהירות.
מאפיין ייחודי נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא ה-MRI של המוח באתרו. המוח MRIs הם ביואריקר. חסר תחליף של מחלת הטרשת נפוצה לכן חיוני לבסס את האפקטים הפתולוגיים של אותות MRI חריגים. המחקרים שלנו הקימו כי הן T2 בלבד ו T2T1MTR ROIs הן לעתים קרובות מיאלואידית. ממצא זה תומך בצורך ביותר שיטות דימות ספציפיות יותר, אשר מבחינים באופן מהימן בין החומר הלבן של המוח המיאלואידית והמיאלואידית. MRI נראה רגיש לזיהוי של מיאלין, אבל המחקרים שלנו מדגימים כי אפילו שילוב של T1/T2/MTR אינו ספציפי לזיהוי מיאלונציה. הפרוטוקול שלנו לאחר המוות מספק פלטפורמה אידיאלית לבדיקת היכולת של שיטות דימות חדשות כדי להבחין בין החומר הלבן המוח המנטול והמיאלואידית. MRI מספק גם את הרכב האידיאלי לתרגום של תוצאות המדע הבסיסי לתוך הפרקטיקה הקלינית, בהינתן השימוש ב-MRI במחקר הטרנסלאליות שלנו והשימוש הקליני הנרחב שלה בחולים חיים.
בעוד חיתוך קצר, ארוך קבוע, כמו גם פרוסות קפואות מציע יתרון לעיבוד רקמות במצבים מרובים עבור מחקרים שונים, יש כמה מגבלות עם שיטה זו. ייתכן שהערכת כולו של מבנה עשויה להיות מוגבלת כאשר חלקים ממנו עשויים להיות מעובדים באופן שונה בפרוסות סמוכות. הנפח הגדול של קופת הרקמה, עם זאת, מציע את היכולת לחקור מבנה של עניין בנושאים מרובים כדי לשפר את הדגימה. מגבלה כללית נוספת למחקרים ניצול רקמות שלאחר המוות היא שהם חוצים את החתך. מסקנות בנוגע לתזמון והתקדמות של שינויים צריכים להתפרש בהקשר זה. ייתכנו הטיית בחירה לחולים שתורמים את הרקמות שלהם, אשר עשויים להגביל את הכללה של נתונים לכל המטופלים עם MS. מכיוון שרוב התורמים מתים מסיבוכים של MS מתקדמת, זה לא יכול להיות מתאים להסיק ממצאים מהחולים האלה לאלה בשלבים המוקדמים של MS. עם זאת, קיבלנו רקמות מחולים צעירים שמתו מתנאים שאינם הקשורים ל-MS (כלומר, אוטם שריר הלב חריפה, מנת יתר של התרופה, התאבדות). היקף הפרוטוקול שלנו אינו כולל דגימת איברים אחרים (למשל, מח עצם ומערכת העיכול) אשר היו מעורבים ב-MS. אנו מאמינים כי העוצמות של התוכנית עולה במידה רבה על מגבלותיו.
The authors have nothing to disclose.
המחברים גם רוצים להודות לד ר כריסטופר נלסון על מערכת הסיוע. תוכנית הנתיחה שלאחר המוות נתמכת בחלקו על ידי R35 גראנט NS097303 ל-BDT. העבודה במעבדה של RD נתמכת על ידי מענקים מ-NINDS (NS096148) והאגודה הלאומית לטרשת נפוצה, ארה ב (RG 5298).
Antibodies | |||
Biotinylated goat anti-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336171 |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 1:500 dilution. |
Biotinylated goat anti-rat IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | 1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30µm free-floating. RRID: AB_2336208 |
Glial fibrillary acid protein (GFAP) | Dako | Z0334 | 1:700 dilution for hemispheric. RRID: AB_10013382 |
HuR, mouse IgG, 3A2 clone | Santa Cruz | SC-5261 | 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_627770 |
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 | Dako | Mo746 | 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30µm free floating. RRID: AB_2313661 |
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) | Biolegend | 801701 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564642 |
Phosphorylated neurofilament (SMI31) | Biolegend | 801601 | 1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30µm free-floating. RRID: AB_2564641 |
Proteolipid protein (PLP) | Gift from Wendy Macklin | 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available. | |
Reagents | |||
125 mm filter paper | Whatman | 1452-125 | For filtering PFA. |
50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | Electron microscopy grade. |
Cytoseal | ThermoScientific | 8310-16 | |
Ethylene glycol | Fisher Chemical | BP230-4 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | 400mL/2L Cryoprotection solution. |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore-Sigma | SLHV033RB | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19200 | Prills form. |
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) | Fisher Chemical | BP220-212 | |
Sodium azide | Fisher Chemical | S227I | 2g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S0876 | 98.8g/2L Sorenson's buffer. |
Sodium phosphate mono basic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | 14.352g/2L Sorenson's buffer. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | PVP40-500G | |
VectaStain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | 1:1000 dilution of A and B. RRID: AB_2336819 |
Waterproof drawing black ink | Higgins | 44201 | |
Xylene | Fisher Chemical | X3S | Histological grade. |
Equipment | |||
3T MRI Magnetom Prisma | Siemens Healthineers | ||
7T MRI Agilent 830AS | Siemens Healthineers |