Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung
Summary
Wir zeigen die Synthese von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für effektive in vitro und in vivo Oligonukleotid-Lieferung. Poröses Silizium-Nanopartikeln sind beladen mit SiRNA den Kern bilden die durch Fusogenic Lipide durch Extrusion die Shell zu bilden beschichtet ist. Targeting glyko-Funktionalisierung und Partikelcharakterisierung sind im Preis inbegriffen.
Abstract
Mit dem Aufkommen der Gentherapie ist die Entwicklung einer wirksamen in-vivo-Nukleotid-Nutzlast-Delivery-System der Parallelimport geworden. Fusogenic poröse Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) haben vor kurzem gezeigt, hohen in-vivo Gen-silencing Wirksamkeit aufgrund seiner hohen Oligonukleotid Tragfähigkeit und einzigartige zelluläre Aufnahme Weg, der Endozytose vermeidet. Die Synthese von F-pSiNPs ist ein mehrstufiger Prozess, der enthält: (1) laden und Abdichtung des Oligonukleotids Nutzlasten in den Silizium-Poren; (2) gleichzeitige Beschichtung und Dimensionierung der Fusogenic Lipide um die poröse Silizium-Kerne; und (3) Konjugation von targeting Peptide und waschen um überschüssige Oligonukleotid, Silizium Schmutz und Peptid zu entfernen. Die Partikel Größe Einheitlichkeit zeichnet sich durch dynamische Lichtstreuung und seine Kern-Schale-Struktur von Transmissions-Elektronenmikroskopie überprüft werden kann. Die Fusogenic-Aufnahme ist durch das Laden eines lipophilen validiert färben, 1, 1′-Dioctadecyl-3,3, 3′, 3′-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI), in der Fusogenic-Lipid-Bilayer und behandeln Sie es um Zellen in vitro Plasmamembran Färbung im Vergleich zu beobachten endocytic Lokalisierungen. Targeting und in-vivo Gen-Silencing-Wirksamkeiten wurden zuvor in einem Mausmodell der Staphylococcus Aureus Lungenentzündung, quantifiziert in denen targeting Peptid wird voraussichtlich die F-pSiNPs zu Haus, um den Ort der Infektion zu helfen. Über ihre Anwendung in S. Aureus -Infektion kann das F-pSiNP-System zur jeder Oligonukleotid für Gen-Therapie einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich virale Infektionen, Krebs und Autoimmunerkrankungen zu liefern.
Introduction
Gentherapie moduliert spezifische Genexpression um ein therapeutisches Ergebnis zu erhalten. Zahlreiche Werkzeuge für gen-Modulation entdeckt und untersucht, einschließlich der Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi) mit Oligonukleotiden (z. B. kurze interferierende RNA (SiRNA)1,2, MicroRNA (MiRNA)3,4 ), DNA Plasmide5,6, Nukleasen (z. B. Zinkfinger, TALENS)7,8und CRISPR/Cas9 Systeme9,10. Während jedes Werkzeug Wirkmechanismus unterscheidet, müssen alle Werkzeuge der Zelle Zytoplasma oder Nucleus aktiv sein erreichen. So, während diese Werkzeuge induzieren signifikanten Effekt Modulation der gen-Expression in vitro nachgewiesen haben, leidet die in-vivo Wirksamkeit extrazellulären und intrazellulären Hindernisse. Da die Werkzeuge der biologischen Ursprungs sind, gibt es viele Enzyme und Abfertigungssysteme in unserem Körper, die Fähigkeit zu degradieren oder fremde Moleküle11zu entfernen. Auch in dem Fall, dass die Werkzeuge die Zielzelle erreichen leiden sie Endozytose; ein Modus der zelluläre Aufnahme, die kapselt und fallen die Werkzeuge im sauren Magen-wie Bläschen, die verschlechtern oder die Werkzeuge aus der Zelle zu vertreiben. In der Tat haben Studien gezeigt, dass Lipid Nanopartikel Endocytosed über Macropinocytosis, von denen etwa 70 % der SiRNA aus den Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Aufnahme12,13exocytosed sind. Der Großteil der verbleibenden SiRNA sind durch die lysosomalen Pathway abgebaut und letztlich erreichen nur 1-2 % der SiRNA, die zunächst die Zelle mit den Nanopartikeln betritt Endosomal Flucht potenziell RNAi13,14 unterziehen .
Wir haben vor kurzem Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln (F-pSiNPs) entwickelt, die einen SiRNA-geladenen Kern bestehend aus porösem Silizium-Nanopartikeln und Fusogenic Lipid Schale15haben. Die F-pSiNPs präsentieren drei große Vorteile gegenüber anderen konventionellen Oligonukleotid-Delivery-Systeme: (1) ein Fusogenic Lipid Beschichtung, wodurch die Teilchen zu umgehen Endozytose und liefern die gesamte Nutzlast direkt in das Zytoplasma der Zelle (im Gegensatz zu den 1 %-2 % erzielt durch Endocytosed Partikel13,14) (Abbildung 1). (2) hohe Masse geladen von SiRNA in der pSiNPs (> 20 Gew.-% im Vergleich zu 1-15 Gew.-% von herkömmlichen Systemen)15, die schnell im Zytoplasma verschlechtern (Sobald die Core-Partikel die Lipid-Beschichtung über Fusogenic Aufnahme Schuppen), lassen Sie die SiRNA; (3) gezielt Peptid Konjugation für selektive Homing, Zelltypen in-vivo gewünscht.
Die F-pSiNP-System hat bedeutende Gen-silencing Wirksamkeit gezeigt (> 95 % in-vitro-; > 80 % in-vivo) und anschließende therapeutische Wirkung in einem tödlichen Mausmodell der S. Aureus -Pneumonie; die Ergebnisse waren vorher15veröffentlicht. Allerdings erfordert die komplexe Struktur des F-pSiNP Systems Feingefühl und fein abgestimmte Optimierung, homogen und beständig Nanopartikel zu generieren. So soll der Zweck dieser Arbeit eine gründliche Protokoll sowie Optimierung von Strategien für die Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von F-pSiNPs in gezielte Bereitstellung von SiRNAs für potente Gen-Silencing-Effekt verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synthese von porösem Silizium-Nanopartikeln ist in Abbildung 5dargestellt. Der entscheidende Schritt bei der Synthese von Fusogenic pSiNPs ist im Laden Schritt (Schritt 3). Wenn die Fusogenic Nanopartikel aggregieren sind Post-Synthese (Abbildung 3), kann aufgrund der folgenden Gründe geben: (1) Kalzium-Chlorid-Lager war nicht homogen bereit, damit Schritt 3.1.2 muss sorgfältig gefolgt oder verfeinert; oder (2) das Verhältnis der pSiNP: SiRNA: CaCl2</su…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt durch die National Institutes of Health durch Vertrag # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
Referenzen
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