Lipidómica y Transcriptómica en Enfermedades Neurológicas

Los recientes avances en la función de los lípidos y su papel en la aparición y progresión de enfermedades neurológicas abren nuevos lugares de investigación y desarrollo de nuevas dianas terapéuticas y elucidación del mecanismo de la ^enfermedad1. Las diferencias documentadas en la composición de lípidos en diferentes regiones del cerebro, enfatizadas por las técnicas modernas de imágenes moleculares, como las imágenes de espectrometría de masas y el perfil avanzado de espectrometría de masas, cambian el paradigma de la investigación de lípidos de todo el cerebro hacia regiones cerebrales funcionalmente distintas y discretas. El hecho de que la composición lipídica varíe en diferentes regiones del cerebro provoca una nueva conceptualización tanto de la sensibilidad a los lípidos de la membrana como de la señalización lipídica aguas abajo en respuesta a un insulto o estímulo cerebral a través de las regiones cerebrales funcionalmente distintas. Por lo tanto, los protocolos de lípidos requieren nuevos desarrollos para abordar el desafío de las bajas cantidades de tejido para una detección y cuantificación de mayor resolución espacial y, al mismo tiempo, el análisis de múltiples componentes lipídicos de las membranas celulares y las vías de señalización. Además, la determinación de enzimas, ligandos lipídicos y receptores implicados en la regulación de sus niveles y función es primordial para dilucidar las vías de señalización afectadas en una enfermedad neurológica y guiar nuevas investigaciones mecanicistas en un contexto fisiopatológico.

Además del aumento de la resolución espacial cerebral, hay dos dificultades principales que desafían el desarrollo de nuevos enfoques neurolipidómicos. En primer lugar, las moléculas de señalización lipídica son típicamente de muy baja abundancia en comparación con los lípidos constitutivos de membrana. En segundo lugar, el lipidoma exhibe una alta heterogeneidad estructural, difícil de diseccionar utilizando un único enfoque analítico. Por lo tanto, los métodos de extracción y análisis se adaptan a diferentes categorías de lípidos y se realizan comúnmente en distintas muestras de tejido.². Métodos lipidómicos de escopeta³ son excelentes herramientas para revelar rápidamente un amplio perfil de lípidos de membrana, mientras que el aumento de la sensibilidad y la selectividad ofrecidas por los métodos espectrométricos de masas de descubrimiento y cuantificación dirigidos se aprovechan para la investigación de lípidos de señalización de baja abundancia, incluidos: i) lípidos inflamatorios y ii) lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como endocannabinoides (eCB), lípidos vinculados a aminoácidos, etc.^4,5. Para abarcar los cambios lipídicos tanto a nivel de membrana celular como de señalización que ocurren en las regiones cerebrales de los modelos de enfermedades neurológicas, generalmente la extracción y el análisis de lípidos se llevan a cabo en distintas muestras de tejido, obtenidas de distintos lotes de animales o de diferentes hemisferios, o diseccionando una región de tejido más grande en múltiples piezas. Cuando los niveles de ARNm de los receptores enzimáticos también son de interés, su investigación generalmente requiere la obtención de una muestra de tejido distinta. Por ejemplo, la investigación de lípidos de membrana, cannabinoides endógenos y ARNm requeriría tres muestras de tejido diferentes (por ejemplo, dos muestras para los dos métodos de extracción de lípidos -lípidos de membrana y lípidos de señalización- y dos métodos posteriores de análisis de lípidos- y una muestra para el análisis de ARNm). La investigación de lípidos inflamatorios y cannabinoides endógenos requiere dos muestras de tejido distintas, métodos de extracción y métodos de análisis, respectivamente. Otro ejemplo es la investigación del ARNm y de cualquier categoría de lípidos en una muestra de punzón cerebral o microdisección láser que, en consecuencia, requiere que dos animales distintos obtengan dos muestras por (sub)región cerebral. En tales casos se produce con frecuencia un grado sustancial de variabilidad y/o escasa reproducibilidad de los resultados, originándose en la variabilidad biológica y/o la heterogeneidad tisular. Guiados por estas limitaciones prácticas del análisis multimolecular, que ocurren particularmente a alta resolución espacial en el cerebro, se diseñó un protocolo neurolipidómico de tres módulos que abarca: 1) coextracción y coanálisis por LC / MRM de lípidos inflamatorios (por ejemplo, eicosanoides (eiCs)) y lípidos involucrados en la modulación de la actividad neuronal, como eCBs²; 2) co-extracción de fosfolípidos (PL) y eCB con posterior análisis multiescanal LC/MRM y precursor/neutral de pérdida²; y 3) extracción dual de (fosfo)lípidos de membrana y eCBs, así como ARNm, con posterior análisis de secuenciación LC/MRM y qPCR o ARN⁶. Dependiendo de la cuestión biológica a abordar en una enfermedad neurológica y la región cerebral de interés, se puede aplicar una combinación del primer y segundo protocolo, o el primer y el tercer protocolo, en la misma muestra de tejido para tejidos que pesan alrededor de 4 mg. El primer y tercer protocolo se pueden aplicar de forma independiente para tejidos de alrededor de 2 mg. El segundo protocolo se puede aplicar para tejidos que pesan tan poco como 0,5 mg. Independientemente del módulo de protocolo neurolipidómico seleccionado, el muestreo de tejido y el procesamiento preanalítico, el aislamiento cerebral y la disección de la región, así como el procedimiento para sacrificar el modelo animal están estandarizados e idénticos para los tres módulos del protocolo. En nuestra investigación de enfermedades neurológicas, los órganos periféricos que son relevantes para las consecuencias patológicas de la enfermedad siempre se recopilan y analizan utilizando estos protocolos modulares. Además, la sangre se muestrea regularmente para lipidómica plasmática para servir como una herramienta de lectura de enfermedades neurológicas con vistas a posibles aplicaciones traslacionales. El protocolo de lipidómica modular aquí presentado es muy versátil: escalable a cantidades de tejido más grandes y fácilmente aplicable para prácticamente cualquier tipo de tejido y enfermedad. Para la aplicación del protocolo modular (Figura 1) en las enfermedades neurológicas, cualquier modelo estandarizado de roedores de inicio y progresión de trastornos neurológicos, como la lesión cerebral traumática, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la epilepsia son susceptibles.

Estos protocolos se han aplicado ampliamente para estudiar los cambios en el lipidoma tisular y/o el transcriptoma en la fase aguda de la epilepsia en el modelo de epilepsia inducida por ácido kínico (KA)^2,7, modelo ampliamente utilizado en estudios preclínicos debido a la semejanza con la epilepsia del lóbulo temporal humano (TLE)^8,9,10,11. Utilizando estos protocolos, se evaluó el potencial terapéutico de fármacos como la Palmitoiletanolamida (PEA)^12,13 en el mismo modelo de ratón de epilepsia. El estudio identificó cambios en los lípidos y el ARNm a alta y baja resolución espacial en el cerebro y la periferia, en el punto temporal de las intensidades máximas de convulsiones agudas (a los 60 minutos de inducción posterior a la incautación) y en el tratamiento subcrónico y agudo con PEA en cuatro puntos de tiempo diferentes (20, 60, 120 y 180 min) después de la inducción de la convulsión ka, una ventana de tiempo que cubre la fase aguda de la epilepsia. El plasma, los cerebros y los órganos periféricos de ratones no tratados inyectados con KA, ratones tratados con PEA aguda y subcrónicamente, así como ratones de control de vehículos y vehículos PEA, se recolectaron en cada punto de ^tiempo12,13 y se investigaron con este análisis molecular. Los datos moleculares se correlacionaron con fenotipos conductuales obtenidos por puntuación de convulsiones, así como con datos derivados de inmunohistoquímica sobre procesos neurodegenerativos, con el fin de desentrañar la progresión de la fase de epilepsia aguda y el potencial de la PEA para aliviarla.