这份手稿描述了一种基于 fac 的从人的皮肤中分离状和网状成纤维细胞的协议。它规避了体外培养, 这是不可避免的与常用的隔离协议通过外植体培养。所产生的成纤维细胞亚群功能不同, 在真皮内显示出不同的基因表达和定位。
成纤维细胞是一种高度异质性的细胞群, 与许多人类疾病的发病机制有关。在人类皮肤真皮 , 成纤维细胞传统上归因于浅状或下网状真皮根据其组织学定位。在小鼠真皮中 , 状和网状成纤维细胞起源于两个不同的谱系 , 在生理和病理过程中具有分化的功能 , 并有一个独特的细胞表面标记表达谱 , 通过这些特征可以区分它们。
重要的是, 来自浅层和低真皮层的外植体培养的证据表明, 人类皮肤真皮中至少存在两种功能不同的真皮成纤维细胞谱系。然而, 与小鼠皮肤不同的是, 能够识别不同成纤维细胞亚群的细胞表面标记尚未为人体皮肤建立。我们开发了一种新的方案 , 通过荧光激活细胞分选 ( FACS ) 分离人类状和网状成纤维细胞群的方法 , 使用两个细胞表面标记成纤维细胞激活蛋白 ( FAP ) 和胸腺细胞抗原 ( Thy1 ) / CD90 。这种方法可以在没有体外操作的情况下分离纯成纤维细胞亚群, 从而影响基因表达, 从而能够准确地分析人真皮成纤维细胞亚群在组织稳态或疾病方面的功能分析病理。
成纤维细胞作为结缔组织的主要细胞成分, 主要负责胶原蛋白和弹性纤维的沉积, 最终形成细胞外基质1, 因此, 它们在组织稳态、再生和疾病长期以来一直被低估。然而, 成纤维细胞最近成为研究人员关注的焦点, 这不仅是因为它们是诱导多能干细胞2的重要细胞来源,还因为它们在其发病机制中具有很高的可塑性和意义。多种疾病, 如器官纤维化3,4,5或癌症6,7。
人的皮肤是由多层上皮 , 表皮 , 其底层结缔组织 , 真皮 , 这可以组织学细分为上状和下网状真皮 , 主要由成纤维细胞和细胞外基质8和皮下组织。根据皮肤成纤维细胞在组织中的位置 , 皮肤成纤维细胞大致分为状和网状成纤维细胞1。
重要的是, 最近的数据表明, 这些真皮成纤维细胞亚群不仅在组织学上是可区分的, 而且其功能也有相当大的差异。在小鼠皮肤中 , 状和网状成纤维细胞在胚胎发生过程中产生于两个不同的谱系9。一些证据表明, 这两种血统不仅在组织稳态、毛囊形态发生、伤口修复和纤维化方面发挥着不同的作用, 而且对不同的疾病也有反应来自肿瘤表皮干细胞的信号 11, 表明不同的作用在癌症的发病机制。方便的是, 这两个血统在成年小鼠皮肤中表达了一套独特的相互排斥的细胞标记物, 从而能够分离出纯真皮成纤维细胞群, 并随后对其在体外的具体功能进行广泛分析9,11个。
相应地, 至少有两个不同的成纤维细胞亚群具有不同的形态和功能, 包括分化的增殖率, 组织重塑能力12,13, 以及支持生长的能力表皮干细胞体外, 已描述为人类皮肤真皮14,15。然而 , 已发表的关于人真皮成纤维细胞的研究大多是使用从皮肤外植体培养物中分离出的混合成纤维细胞群体进行的 , 因为特定的细胞表面标记集能够分离出纯人类状体或网状成纤维细胞亚群类似于小鼠真皮尚未建立。
我们最近已经证明 , 人类皮肤状和网状成纤维细胞的特点是特定的细胞表面标记 , 使分离各自的亚群通过荧光激活细胞分选 ( 流式细胞组织 )16 : fap+CD90成纤维细胞代表状成纤维细胞主要位于上真皮 , 表现出较高的增殖率 , 独特的基因特征 , 但没有脂原体的潜力。FAP+cd90+和 fa-cd90+成纤维细胞属于下真皮隔间的网状谱系, 这些隔间增殖较少, 但容易发生脂肪生成–网状成纤维细胞的标志.这种方法使广泛研究这些明显的成纤维细胞亚群, 不仅在生理条件下的特定功能, 而且在包括皮肤癌的皮肤病的发病机制的背景下。
然而, 由于成纤维细胞改变了其细胞表面标记在二维体外培养中的表达 16, 17, 19, 我们的协议的应用仅限于分离原代生细胞与人真皮 , 不允许在混合细胞培养群体中识别状或网状成纤维细胞。重要的是, 尽管细胞表面标记的表达在体外发生了变化, 但我们已经证明, 根据下面描述的协议分离的成纤维细胞子集在培养16时保留了其特定的功能, 从而能够生理或病理条件下亚基特异性特性的体外研究。
总之, 我们开发了一种通过流式细胞仪分离明显成纤维细胞亚群的方案, 首次允许将纯成纤维细胞群与处于幼稚状态的人皮肤真皮分离。
在这篇文章中 , 我们描述了一种方法 , 从人的皮肤上分离状和网状成纤维细胞。Cd90 已广泛用于皮肤成纤维细胞 18、20、21 的鉴定或分离。然而, 我们已经证明, 除了 CD90+ 成纤维细胞, 人类真皮还含有 CD90 -成纤维细胞群, 表示 fap16, 这已被确立为活化成纤维细胞和与肿瘤相关的成纤维细胞的标记 (Caf)22,23,24,25。重要的是, 我们能够识别三个成纤维细胞亚群 FAP+ cd90–, fap+cd90+和 fap–cd90+在皮肤活检从所有健康的人类捐献者。因此, 我们得出结论, FAP 不仅是活化成纤维细胞或 Caf 的标记, 也是正常的组织成纤维细胞。
值得注意的是, 在应用上述排除和门控策略后, fap-cd90-细胞群不包含成纤维细胞, 因为这些细胞在体外不会在成纤维细胞培养介质中增殖, 但大多数可能是一个混合细胞群, 包括淋巴细胞和周周细胞等 16.
通过使用上述协议获得的细胞产量可能因用于隔离的皮肤部位的身体部位而有所不同。不同身体部位的真皮因其结构、厚度以及胶原蛋白成分而异。例如, 面部或上臂的皮肤比腹部或大腿的皮肤薄很多, 腹部或大腿的皮肤也经常显示较厚的皮下脂肪层。此外, 皮肤捐献者的年龄和性别不仅可能进一步影响组织离解效率, 而且可能影响三个成纤维细胞亚群的分布 (图 3), 当从全厚度的皮肤中分离。这是由于状真皮缩小 , 成纤维细胞总数随着年龄的 11,26, 27,28而减少。此外 , 状真皮的细胞颗粒可能会比网状真皮大 , 因为上真皮比网状真皮更密集地由成纤维细胞填充。此外, 较低的真皮也是更硬的, 更密集的胶原蛋白, 使它更难分离的组织和释放成纤维细胞。值得注意的是, 细胞颗粒可能会出现非常红, 这也是建议红血球裂解的原因。
除了识别完整的人的皮肤中的三个亚群外 , 我们还表明 , 在皮肤皮肤上 , 每个成纤维细胞子集在状或网状真皮16中都是丰富的。用皮肤切割皮肤是至关重要的, 以获得适当的丰富每个亚群从不同的皮肤层。由于状真皮非常薄 , 代表它的皮肤切片厚度不应超过300μm . 上网状和下网状成纤维细胞都代表网状血统 , 并显示相似的功能和基因签名 ,因此, 人们也可以考虑不将它们分开。
重要的是 , 所有三个成纤维细胞种群在真皮中都有发现 , 并不完全存在于一层 , 这就是为什么状或网状真皮的外植体培养物导致混合成纤维细胞培养。然而 , FAP+cd90–状成纤维细胞在状真皮中最丰富 , 从浅层到下真皮层呈梯度 , 而 fap+cd90 + 和 fap – cd90 +成纤维细胞则遵循从较低的层到浅层的逆梯度16。此外 , 状真皮的 CD90+成纤维细胞几乎完全存在于血管周围 , 并表达血管周围成纤维细胞标记 cd146 29 ,因此可能表现出不同的功能。剩余 CD146–网状成纤维细胞16。CD146 可作为门控战略中的另一个标记, 以排除这一人群。
在真皮层分离后, 分离细胞被染色一种专门设计的抗体鸡尾酒, 其中含有各种抗体, 用于排除免疫细胞、内皮细胞和淋巴细胞、表皮细胞、红细胞和骨髓间充质干细胞。获得纯成纤维细胞的数量。值得注意的是, 选择一个标记来识别和排除骨髓间充质干细胞可能会很棘手, 因为已发布的 msc 标记 30、31的数量很多。由于骨髓间充质干细胞像成纤维细胞一样表达 CD90, 因此额外的 MSC 标记 (如 CD105 或 CD271) 可被证明对其鉴定有用。然而, 骨髓间充质干细胞只占所有真皮细胞的比例很低, 而且由于 CD90+成纤维细胞在分类时显示出典型的成纤维细胞形态特征, 人们可能会认为, 使用不同的细胞表面标记排除骨髓间充质干细胞可能会是不必要的。
重要的是, 我们分析了 FAP 和 CD90 基因表达后, 保持细胞在培养7-14 后排序 (未显示的数据), 并发现这两个标记的表达是在各自的排序单阳性 (FAP+cd90–或FAP–cd90+) 细胞16。因此, 我们强调, 上述标记集和协议允许直接从组织中分离原生成纤维细胞亚群, 但不允许从以前培养的混合成纤维细胞群体中分离。
然而 , 我们证明 , 所有三个亚群的功能保留在细胞培养中 , 而不考虑细胞表面标记表达的变化 , 因为成纤维细胞排序为 fap + cd90–状成纤维细胞不在较长的培养期后获得接受脂肪生成的能力, 而将成纤维细胞排序为 fap + cd90+或fap– cd90 + 网状成纤维细胞保持其分化为脂肪细胞的能力16.重要的是 , 我们还发现 , 状和网状特异性基因在 FAP+cd90– 和cd90+中的表达程度仍然较高。
总之, 我们建立了一个通过流式细胞仪分离功能不同的成纤维细胞亚群的协议, 该方案首次允许从人体皮肤真皮中分离和分析纯和天真的成纤维细胞亚群。该方法确立了从上、下真皮对常用的成纤维细胞外植体培养分离方案的重大推进 , 因为 ( i ) 从皮肤表面到真皮下存在状和网状成纤维细胞的相反梯度 , 以及 ( ii )成纤维细胞在体外改变基因特征。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Bärbel Reininger 和 Wolfgang Bauer 在 fns 分拣方面提供的协助。这项工作得到了奥地利科学基金 (FWF:V 525-B28) 和欧洲生化协会联合会 (FEBS, 后续研究基金) 向 b. m. l. 提供的赠款的支持。S. F. 是奥地利科学院 (OeAW) doc 研究金的获得者。我们感谢维也纳医科大学核心设施的大力支持。我们感谢 Bernhard Gesslbauer、Christine Radtke 和 Martin Vierhapper 提供的人体皮肤材料。
Material: | |||
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | ! CAUTION |
C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | ! CAUTION |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | ! CAUTION |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | ! CAUTION |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | ! CAUTION |
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | ! CAUTION |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
OilRed O | Sigma | O-0625 | |
Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ | Lonza | BE17-512F | |
Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | ! CAUTION Skin and eye irritant. |
Troglitazone | Sigma | T2573 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry Antibodies: | |||
anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
Tea strainer | x | x | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibroblast growth medium: | |||
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S |