Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.
Los fibroblastos son una población celular altamente heterogénea implicada en la patogénesis de muchas enfermedades humanas. En la dermis cutánea humana, los fibroblastos se han atribuido tradicionalmente a la dermis superficial papilar o reticular inferior según su localización histológica. En la dermis del ratón, los fibroblastos papilares y reticulares proceden de dos linajes diferentes con funciones divergentes en cuanto a procesos fisiológicos y patológicos y un perfil de expresión de marcador de superficie celular diferenciado por el cual pueden distinguirse.
Es importante destacar que la evidencia de cultivos explicativos de capas dérmicas superficiales y más bajas sugieren que al menos dos linajes de fibroblastos dérmicos funcionalmente distintos existen también en la dermis de la piel humana. Sin embargo, a diferencia de la piel del ratón, los marcadores de superficie celular que permiten la discriminación de diferentes subconjuntos de fibroblastos aún no se han establecido para la piel humana. Desarrollamos un nuevo protocolo para el aislamiento de las poblaciones de fibroblastos papilares y reticulares humanos a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando los marcadores de superficie celular de proteína de activación de fibroblastos (FAP) y el antígeno de thymocyte 1 (Thy1)/CD90. Este método permite el aislamiento de los subconjuntos de fibroblastos puros sin manipulación in vitro, lo que demostró afectar la expresión génica, permitiendo así un análisis funcional preciso de los subconjuntos humanos de fibroblastos en relación con la la homeostasis tisular o la enfermedad Patología.
Como el principal componente celular del tejido conectivo, los fibroblastos son principalmente responsables de la deposición de colágeno y fibras elásticas que en última instancia forman la matriz extracelular1, y por lo tanto, su papel en la homeostasis tisular, regeneración y enfermedad se ha subestimado durante mucho tiempo. Sin embargo, los fibroblastos han llegado recientemente bajo el foco de los investigadores, no sólo porque representan una fuente celular prominente para las células madre pluripotentes inducidas2 sino también debido a su alta plasticidad e implicación en la patogénesis de un gran número de enfermedades como la fibrosis orgánica3,4,5 o cáncer6,7.
La piel humana se compone de un epitelio multicapa, la epidermis, y su tejido conectivo subyacente, la dermis, que se puede subdividir histológicamente en el papilar superior y la dermis reticular inferior y se compone principalmente de fibroblastos y matriz extracelular8 y la hipodermis. Según su ubicación dentro del tejido, los fibroblastos dérmicos se han clasificado aproximadamente en fibroblastos papilares y reticulares1.
Es importante destacar que los datos recientes indican que estas subpoblaciones de fibroblastos dérmicos no sólo son distinguibles histológicamente, sino también que su función es considerablemente diversa. En la piel del ratón, los fibroblastos papilares y reticulares surgen de dos linajes distintos durante la embriogénesis9. Varias líneas de evidencia sugieren que los dos linajes ejercen diferentes funciones no sólo en la homeostasis tisular, la morfogénesis del folículo piloso, la reparación de heridas y la fibrosis7,9,10, sino que también responden a diferentes señales de las células madre epidérmicas neoplásicas11, sugiriendo roles divergentes en la patogénesis del cáncer. Convenientemente, ambos linajes expresan un conjunto diferenciado de marcadores celulares mutuamente excluyentes en la piel adulta del ratón, permitiendo así el aislamiento de las poblaciones de fibroblastos dérmicos puros y el análisis extenso subsiguiente de sus funciones específicas in vitro9 , 11.
Correspondientemente, al menos dos subconjuntos de fibroblastos distintos con morfología y funciones distintas, incluyendo tasas de proliferación divergentes, capacidades de remodelación de tejidos12,13, así como la capacidad de apoyar el crecimiento de células madre epidérmicas in vitro, se han descrito para la dermis de la piel humana14,15. Sin embargo, la mayoría de los estudios publicados sobre los fibroblastos dérmicos humanos se han realizado utilizando poblaciones mixtas de fibroblastos aislados de las culturas explicadas de la piel dermatomed, ya que los conjuntos de marcadores de superficie celular específicos que permiten el aislamiento del papilar humano puro o las subpoblaciones de fibroblastos reticulares en analogía con la dermis del ratón aún no se establecieron.
Recientemente hemos demostrado que los fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana se caracterizan por marcadores específicos de superficie celular que permiten el aislamiento de las respectivas subpoblaciones a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)16: FAP + CD90– fibroblastos representan fibroblastos papilares localizados principalmente en la dermis superior, presentando mayores tasas de proliferación, una distintiva firma génica pero sin potencial adipogénico. FAP+CD90+ y FAP–CD90+ fibroblastos pertenecen al linaje reticular de los compartimentos dérmicos inferiores, que son menos proliferativos pero se someten fácilmente a la adipogénesis, un sello distintivo para los fibroblastos reticulares. Este método permite estudiar extensamente estas subpoblaciones de fibroblastos distintos no sólo en lo que respecta a sus funciones específicas en condiciones fisiológicas, sino también en el contexto de la patogénesis de enfermedades cutáneas incluyendo el cáncer de piel.
Sin embargo, dado que los fibroblastos alteran su expresión de marcador de superficie celular en la cultura bidimensional in vitro16,17,19, la aplicación de nuestro protocolo se limita al aislamiento de fibroblastos primarios de humanos DermIS y no permite la identificación de fibroblastos papilares o reticulares en poblaciones mixtas de cultivos celulares. Es importante destacar que, aunque la expresión de los marcadores de superficie celular cambia in vitro, hemos demostrado que los subconjuntos de fibroblastos aislados de acuerdo con el protocolo descrito a continuación conservan su funcionalidad específica cuando se cultivan16, permitiendo así estudios in vitro de propiedades específicas de subconjuntos en condiciones fisiológicas o patológicas.
En conclusión, desarrollamos un protocolo para el aislamiento de diferentes subconjuntos de fibroblastos a través de FACS que por primera vez permite el aislamiento de las poblaciones de fibroblastos puros de la dermis de la piel humana en un estado ingenuo.
En este artículo, describimos un método para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. CD90 ha sido ampliamente utilizado para la identificación o aislamiento de los fibroblastos dérmicos18,20,21. Sin embargo, hemos demostrado que además de los fibroblastos CD90 +, la dermis humana también alberga una poblaciónde CD90- fibroblastos que expresa la FAP16, que se ha establecido como un marcador para los fibroblastos activados y los fibroblastos asociados al cáncer ( CAFS)22,23,24,25. Es importante destacar que hemos sido capaces de identificar tres subpoblaciones de fibroblastos FAP+CD90–, FAP+CD90+ y FAP–CD90+ en biopsias de piel de todos los donantes humanos sanos. Por lo tanto, concluimos que la FAP no es solo un marcador para los fibroblastos activados o los CAFs, sino también los fibroblastos tisulares normales.
Cabe destacar que la población de células FAP–CD90 que queda después de la aplicación de la estrategia de exclusión y de compuerta descrita anteriormente no contiene fibroblastos, ya que estas células no proliferan en el medio de cultivo de fibroblastos in vitro, pero la mayoría probablemente una población celular mixta incluyendo células linfáticos y pericitos entre otros16.
El rendimiento de la célula obtenida mediante el uso del protocolo descrito anteriormente puede variar dependiendo de la parte del cuerpo en la que se origina la pieza de piel utilizada para el aislamiento. La dermis de diferentes partes del cuerpo difiere en cuanto a su estructura, grosor y composición de colágeno. Por ejemplo, la piel de la cara o la parte superior del brazo es mucho más delgada que la piel del vientre o del muslo, que también con frecuencia muestra una capa de grasa subcutánea más gruesa. Además, la edad y el sexo de los donantes de piel pueden no solo afectar la eficiencia de la disociación de los tejidos, sino que también pueden influir en la distribución de las tres subpoblaciones de fibroblastos (figura 3) cuando se aísla de la piel de espesor completo. Esto resulta del hecho de que la dermis papilar se encoge y que los números de fibroblastos totales disminuyen con11,26,27,28años. Además, el pellet celular de la dermis papilar probablemente será mayor que el de la dermis reticular, ya que la dermis superior está densamente poblada por fibroblastos que la dermis reticular. Además, la dermis inferior también es más dura y más densamente embalada con colágeno, lo que dificulta la disociación del tejido y la liberación de los fibroblastos. Cabe destacar que el pellet de células puede aparecer muy rojo, por lo que se recomienda la lisis de los glóbulos rojos.
Además de la identificación de tres subpoblaciones en la piel humana intacta, también mostramos que en la piel dermatomed, cada subconjunto de fibroblastos se enriquece ya sea en la dermis papilar o reticular16. El corte preciso de la piel con el dermatoma es fundamental para obtener un enriquecimiento adecuado de cada subpoblación de diferentes capas dérmicas. Dado que la dermis papilar es muy delgada, la rebanada dermatomed que lo representa no debe exceder un espesor de 300 μm. los fibroblastos reticulares y reticulares superiores representan el linaje reticular y muestran funciones y firmas genéticas similares, por lo tanto, uno también podría considerar no separarlos.
Es importante destacar que las tres poblaciones de fibroblastos se encuentran en toda la dermis y no están presentes exclusivamente en una capa, por lo que las culturas explicadoras de la dermis papilar o reticular resultan en cultivos mixtos de fibroblastos. Sin embargo,los fibroblastos CD90– papillarios son más abundantes en la dermis papilar y siguen un gradiente de las capas dérmicas superficiales a inferiores, mientras que la FAP+CD90+ y la FAP–CD90+ fibroexplosiones siguen una gradiente inverso de las capas inferiores a las superficiales16. Además, la mayoría de los fibroblastos CD90+ de la dermis papilar se encuentran casi exclusivamente alrededor de los vasos sanguíneos y expresan el marcador perivasculares de fibroblastos CD14629, y por lo tanto probablemente exhiben diferentes funciones que el fibroblastos CD146– reticulares restantes16. CD146 podría ser utilizado como un marcador adicional en la estrategia de compuerta para excluir a esta población.
Después de la disociación de las capas dérmicas, las células aisladas se tiñen con un cóctel de anticuerpos especialmente diseñado que contiene varios anticuerpo para la exclusión de células inmunitarias, células endoteliales y linfásicas, células epidérmicas, eritrocitos y MSC para obtener poblaciones de fibroblastos puros. De nota, elegir un marcador para la identificación y exclusión de MSCS puede ser complicado debido al alto número de marcadores de MSC publicados30,31. Dado que los MSCs expresan CD90 como los fibroblastos, los marcadores MSC adicionales como CD105 o CD271 podrían resultar útiles para su identificación. Sin embargo, los MSCs solo representan un porcentaje muy bajo de todas las células dérmicas y, puesto que los fibroblastos CD90+ muestran rasgos morfológicos típicos de los fibroblastos tras la clasificación, se podría argumentar que la exclusión de los MSC mediante el uso de marcadores de superficie celular distintos podría ser innecesario.
Es importante destacar que analizamos la expresión génica FAP y CD90 después de mantener las células en la cultura durante 7-14 días después de la clasificación (datos no mostrados) y descubrimos que la expresión de ambos marcadores se alza en el respectivo único positivo ordenado (FAP+CD90– o FAP–CD90+) células16. Por lo tanto, destacamos que los conjuntos de marcadores y el protocolo descritos anteriormente permiten el aislamiento de los fibroblastos primarios que se subestablecen directamente del tejido, pero no de las poblaciones de fibroblastos mixtos previamente cultivadas.
Sin embargo, demostramos que la funcionalidad de las tres subpoblaciones se retiene en el cultivo celular independientemente de la alteración de la expresión de marcador de superficie celular, yaque los fibroblastos clasificados como los fibroblastos CD90– papillarios no adquirir la capacidad de someterse a la adipogénesis después de un período más largo de la cultura, mientras que los fibroblastos clasificados como FAP+CD90+ o FAP–CD90+ los fibroblastos reticulares mantienen su capacidad para diferenciar en adipocitos 16 . Lo que es más importante, también descubrimos que los genes papilares y reticulares específicos todavía se expresan en mayor medida en FAP+CD90– y CD90+ respectivamente.
En conclusión, hemos establecido un protocolo para el aislamiento de subconjuntos de fibroblastos funcionalmente distintos a través de FACS que por primera vez permite el aislamiento y análisis de subpoblaciones de fibroblastos puros e ingenuos de la dermis de la piel humana. Este método establece un avance importante para el protocolo de aislamiento de cultivo de fibroblastos comúnmente utilizado de la dermis superior e inferior como (i) un gradiente opuesto de fibroblastos papilares y reticulares existe desde la superficie de la piel a la hipodermis y (II) los fibroblastos cambian su firma génica in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos con gratitud la asistencia en FACS-clasificación por Bärbel Reininger y Wolfgang Bauer. Este trabajo fue apoyado por becas a b. m. l. del fondo científico austriaco (FWF: V 525-B28), y la Federación de sociedades bioquímicas europeas (FEBS, Fondo de investigación de seguimiento). S. f. es beneficiario de una beca de doctorado de la Academia Austriaca de Ciencias (OeAW). Reconocemos con gratitud el excelente apoyo de las principales instalaciones de la Universidad médica de Viena. Agradecemos a Bernhard Gesslbauer, Christine Radtke y Martin Vierhapper por proporcionar material para la piel humana.
Material: | |||
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | ! CAUTION |
C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | ! CAUTION |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | ! CAUTION |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | ! CAUTION |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | ! CAUTION |
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | ! CAUTION |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
OilRed O | Sigma | O-0625 | |
Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ | Lonza | BE17-512F | |
Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | ! CAUTION Skin and eye irritant. |
Troglitazone | Sigma | T2573 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flow cytometry Antibodies: | |||
anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
Tea strainer | x | x | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibroblast growth medium: | |||
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S |