Biosíntesis de un Flavonol de un Flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo
Summary
La derivación de un flavonol es crucial para su aplicación en la salud y la industria alimentaria. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la biosíntesis de un flavonol de una flavanona y discutimos los pasos cruciales y sus ventajas sobre otros enfoques.
Abstract
Los flavonols son una subclase importante de flavonoides con una variedad de actividades biológicas y farmacológicas. Aquí, proporcionamos un método para la síntesis enzimática in vitro de un flavonol. En este método, Atf3h y Atfls1, dos genes clave en la vía biosintética de los flavonols, se clonan y se sobreexpresan en Escherichiacoli. Las enzimas recombinantes se purifican a través de una columna de afinidad y luego se establece una cascada bienimática en un tampón sintético específico. Dos flavonols se sintetizan en este sistema como ejemplos y se determinan mediante análisis TLC y HPLC/LC/MS. El método muestra ventajas obvias en la derivación de flavonols sobre otros enfoques. Es ahorro de tiempo y mano de obra y altamente rentable. La reacción es fácil de controlar con precisión y, por lo tanto, se amplía para la producción en masa. El producto objetivo se puede purificar fácilmente debido a los componentes simples en el sistema. Sin embargo, este sistema se limita generalmente a la producción de un flavonol a partir de una flavanona.
Introduction
Los flavonols son una subclase importante de flavonoides vegetales y participan en el desarrollo de plantas y pigmentación1,2,3. Más importante aún, estos compuestos poseen una amplia gama de actividades beneficiosas para la salud, tales como contraelcancero4,5, antioxidante6, antiinflamatorio7, antiobesidad8, antihipertensivo9 , y las propiedades de memoria10,lo que conduce a un gran número de estudios sobre estos metabolitos secundarios derivados de plantas. Tradicionalmente, estos compuestos se derivan principalmente de la extracción de plantas utilizando disolventes orgánicos. Sin embargo, debido a su muy bajo contenido en plantas11,12,13, el costo de producción para la mayoría de los flavonols sigue siendo alto, lo que impone grandes restricciones a su aplicación en la salud y los alimentos Industria.
Durante las últimas décadas, los científicos han desarrollado un buen número de métodos para derivar flavonoides14,15. Sin embargo, la síntesis química de estas moléculas complicadas posee una variedad de desventajas intrínsecas16. Requiere no sólo reactivos tóxicos y condiciones de reacción extremas, sino también muchos pasos para producir un compuesto flavonoides objetivo14,17. Además, otro desafío importante en esta estrategia es la síntesis quiral de moléculas flavonoides activas. Por lo tanto, no es una estrategia ideal para producir flavonoides a escala comercial a través de la síntesis química16,17.
Recientemente, los científicos han desarrollado una estrategia alternativa prometedora para producir estos complicados compuestos naturales mediante la ingeniería de microbios con una vía para la biosíntesis de flavonoides18,19,20, 21 , 22, que ha sido descifrado con éxito en las plantas23. Por ejemplo, Duan y otros introdujeron una vía biosintética en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae para producir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produjeron astracpuedeína, un flavonol glucosilado, mediante la introducción deflavanona 3-hidroxilasa (f3h), flavonol sintasa (fls1), y UDP-glucosa:flavonoide 3-O-glucosidasa UGT78K1 genes en Escherichia coliBL21(DE3)17. A pesar de que hay bastantes paradigmas, no todos los microbios genéticamente modificados producen los productos de interés debido a la complejidad de una plataforma celular, la incompatibilidad entre los elementos genéticos sintetizados artificialmente y los anfitriones, el efecto de los productos objetivo contra las células huésped, y la inestabilidad de un sistema celular de ingeniería en sí16.
Otra estrategia alternativa prometedora para la producción de flavonoides es establecer una cascada multienzimática in vitro. Cheng y otros. han informado de que los policítlos de enterocina se pueden sintetizar con éxito mediante el montaje de una vía enzimática completa en una olla25. Esta estrategia sintética sin células elude las restricciones de una fábrica de producción microbiana y por lo tanto es factible para producir algunos flavonoides en gran cantidad16.
Recientemente, hemos desarrollado con éxito un sistema sintético de bienzima para convertir la naringenina (NRN) en KMF en una olla16. Aquí, describimos este sistema con grandes detalles y los métodos involucrados en el análisis de los productos. También presentamos dos ejemplos que utilizan este sistema para producir KMF a partir de NRN y quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Además, discutimos los pasos cruciales de este método y las futuras direcciones de investigación en la biosíntesis de flavonoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un buen número de estudios se centran en la derivación de flavonols debido a su posible aplicación en la atención de la salud y la industria alimentaria. Sin embargo, la extracción tradicional de plantas utilizando disolventes orgánicos y síntesis química poseen desventajas intrínsecas, que restringen su uso en la producción de flavonols. Aquí, informamos de un método detallado para producir un flavonol a partir de una flavanona en una olla estableciendo una cascada bienimática in vitro. Los pasos críticos …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Fondos de Start-up de Profesores Especialmente Nombrados de la Universidad de Yangzhou, los Fondos de Start-up del Profesor Especialmente Nombrado de Jiangsu, el Proyecto Six Talent Peaks en la Provincia de Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016) y un Proyecto financiado por el Programa Académico Prioritario Desarrollo de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Medicina Veterinaria). Agradecemos al Centro de Pruebas de la Universidad de Yangzhou para los análisis HPLC y MS de flavonoides.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
Referenzen
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer’s disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author’s transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
