Purificação e transplante de células progenitoras miogênico derivado Exosomes para melhorar a função cardíaca em camundongos distróficos Muscular de Duchenne
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar a função cardíaca em camundongos de distrofia muscular de Duchenne transitoriamente transplantando exosomes derivado de células progenitoras miogênico normal.
Abstract
Distrofia Muscular Duchene (DMD) é uma doença de genética recessiva ligada ao X causada pela falta da proteína distrofina funcional. A doença não pode ser curada, e como a doença progride, o paciente desenvolve sintomas de insuficiência cardíaca congestiva, arritmia e cardiomiopatia dilatada. Os ratos mutantes DMDMDX não expressam distrofina e são comumente usados como um modelo do rato da DMD. Em nosso estudo recente, observamos aquela injeção Intramiocárdica do tipo largura (WT)-exosomes de derivado de células progenitoras miogênico (MPC-Exo) restaurado transitoriamente a expressão da distrofina no miocárdio de ratos mutantes DMDMDX , que foi associado com uma melhoria transitória da função cardíaca, sugerindo que WT-MPC-Exo pode fornecer uma opção para aliviar os sintomas cardíacos de DMD. Este artigo descreve a técnica de purificação de MPC-Exo e transplante em corações de ratos mutantes DMDMDX .
Introduction
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma ligada ao X recessiva, progressiva doença neuromuscular causada por uma mutação no gene DMD e a perda de distrofina funcional1. Distrofina é expressa principalmente no miocárdio e músculo esquelético e manifesta-se menos no músculo liso, glândulas endócrinas e neurônios2,3. DMD é o tipo mais comum de distrofia muscular, com uma incidência de 1 por 3.500 a 5.000 meninos recém-nascidos em todo o mundo4,5. Indivíduos normalmente desenvolvem necrose muscular progressiva, perda de andar independente pelo início da adolescência e morte nas décadas de suas vidas devido a insuficiência cardíaca e insuficiência respiratória6segundo para terceiro.
Cardiomiopatia dilatada, arritmias e insuficiência cardíaca congestiva são manifestações cardiovasculares comuns de DMD7,8. A doença não pode ser curada, tratamento de suporte pode melhorar os sintomas ou retardar a progressão da insuficiência cardíaca, mas é muito difícil melhorar a função de coração9,10.
Semelhante aos pacientes DMD, distrofia ligada ao X (MDX) ratos são deficientes em proteína distrofina e os sintomas de cardiomiopatia11e, portanto, são amplamente utilizados na pesquisa de cardiomiopatia DMD associado. A fim de restaurar a distrofina em músculos afetados, terapia de células-tronco alogênico provou para ser um tratamento eficaz para DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 vesículas de membrana nm secretadas por vários tipos de células, desempenham um papel fundamental na comunicação célula a célula através do transporte de material genético, como o ARN mensageiro (ARNm) e não-codificantes RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Nossos estudos anteriores mostraram que o exosomes, derivado de células progenitoras miogênico (MPC), tais como linha de celular C2C12, pode transferir distrofina mRNA para anfitrião cardiomyocytes após injeção direta cardíaca22, indicando que entrega alogênico de MPC-derivado exosomes (MPC-Exo) transitoriamente pode restaurar a expressão do gene DMD em camundongos MDX. Este artigo centra-se em técnicas de purificação e transplante de MPC-Exo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de isolar exosomes puro é essencial para estudar a função de exosomes. Uma das técnicas comuns de isolamento do exossomo é Polietilenoglicóis (PEGs) mediada por precipitação17,18,25. Exosomes pode ser precipitado em PEGs e peletizado por centrifugação de baixa velocidade. PEG-mediada purificação é muito conveniente e de baixo custo, não necessita de nenhum equipamento avançado, mas há preocupação com …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang foram parcialmente suportado pela associação americana do coração: GRNT31430008, NIH-AR070029, HL086555-NIH NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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