Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.
Duchene Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessive genetische Krankheit verursacht durch einen Mangel an funktionalen Dystrophin-Protein. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, und wenn die Krankheit fortschreitet, entwickelt der Patient Symptome einer dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz. Die DMDMDX mutierte Mäuse Dystrophin nicht ausdrücklich und werden häufig als ein Maus-Modell der DMD verwendet. In unserer aktuellen Studie beobachteten wir, dass Intramyocardial Injektion von breite Ausführung (WT)-myogen Progenitor Zellen abgeleitet Exosomen (MPC-Exo) vorübergehend restauriert die Expression von Dystrophin im Myokard von DMDMDX mutierten Mäusen, die verbunden WT-MPC-Exo kann eine vorübergehende Verbesserung der Herzfunktion, die darauf hindeutet, dass eine Option, um die kardiale Symptome von DMD zur Verfügung. Dieser Artikel beschreibt die Technik der MPC-Exo-Reinigung und Transplantation in Herzen von DMDMDX mutierten Mäusen.
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal rezessiv, progressive neuromuskuläre Erkrankungen verursacht durch eine Mutation in DMD gen und den Verlust der funktionellen Dystrophin-1. Dystrophin drückt sich vor allem im Skelettmuskel und Myokard und weniger drückt sich in endokrinen Drüsen, glatte Muskulatur und Neuronen2,3. DMD ist die häufigste Form der Muskeldystrophie mit einer Inzidenz von 1 pro 3.500 bis 5.000 Neugeborenen jungen weltweit4,5. Menschen entwickeln in der Regel progressive Muskelentspannung Nekrose, Verlust des unabhängigen Gehens von frühen Jugend und Tod in der zweiten bis dritten Jahrzehnte ihres Lebens durch Herzversagen und Atemstillstand6.
Dilatative Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen und Herzinsuffizienz sind gemeinsame kardiovaskuläre Manifestationen von DMD7,8. Die Krankheit kann nicht geheilt werden, unterstützende Behandlung kann Symptome verbessern oder das Fortschreiten der Herzinsuffizienz zu verzögern, aber es ist sehr schwierig, die Herz-Funktion9,10zu verbessern.
Ähnlich wie bei DMD-Patienten, X-chromosomale Muskeldystrophie (MDX) Mäuse haben einen Mangel an Dystrophin-Protein und vorliegenden Symptome einer Kardiomyopathie11und werden daher häufig in DMD verbundenen Kardiomyopathie Forschung eingesetzt. Um das Dystrophin in den betroffenen Muskeln wiederherzustellen, erweist allogene Stammzell-Therapie sich eine wirksame Behandlung für DMD12,13,14. Exosomen, 30-150 nm Membranvesikel abgesondert von verschiedenen Zelltypen, spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation durch genetische Materialtransport wie Boten-RNA (mRNA) und nicht-kodierende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Unsere frühere Studien haben gezeigt, dass Exosomen abgeleitet myogen Vorläuferzellen (MPC), wie z. B. C2C12 Zelllinie Dystrophin übertragen können mRNA zu Host Kardiomyozyten nach kardialen Direkteinspritzung22, darauf hinweist, dass die allogene Lieferung von MPC-abgeleitete Exosomen (MPC-Exo) können vorübergehend DMD Genexpression in MDX-Mäuse wiederherstellen. Dieser Artikel konzentriert sich auf MPC-Exo-Reinigung und Transplantation-Techniken.
Die Methode der reinen Exosomen zu isolieren ist essentiell für die Funktion der Exosomen zu studieren. Eines der gemeinsamen Techniken für die Exosom Isolierung ist Polyethylen Glykole (PEGs) vermittelte Niederschlag17,18,25. Exosomen können Stifte ausgefällt, und pelleted durch langsame Zentrifugation. PEG-vermittelten Reinigung ist sehr bequem, Low Cost, es braucht keiner vorgerückte Ausrüstung, aber gibt es Bedenken ü…
The authors have nothing to disclose.
Tang waren teilweise unterstützt von der American Heart Association: NIH-AR070029, NIH-HL086555, GRNT31430008, NIH-HL134354.
0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
Centrifuge | Unico | C8606 | |
Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
DMEM | Corning | 10-013-CM | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |