Proporcionar sensibilidad unicelular, citometría de flujo en tiempo real está especialmente preparado para cuantificar las funciones de receptor multimodal de cultivos vivos. Con células progenitoras neurales adultas, la función del receptor P2X7 se evaluó mediante la afluencia de calcio detectado por colorante indicador de calcio, formación de poros transmembrana por absorción de bromuro de etidio y fagocitosis usando gotas de látex fluorescentes.
Citometría de flujo de células vivas se utiliza cada vez más biólogos de célula para cuantificar procesos biológicos en la vida de una cultura de la célula. Este protocolo describe un método por el citómetro de flujo de células vivas se extiende a analizar las múltiples funciones de la activación del receptor P2X7 en tiempo real. Mediante un módulo de tiempo instalado en un citómetro de flujo, funcionalidad de células vivas puede ser evaluado y trazado sobre un determinado período de tiempo para explorar la cinética de la afluencia del calcio, formación de poros transmembrana y fagocitosis. Este sencillo método es ventajoso como tres funciones canónicas del receptor P2X7 pueden evaluarse utilizando una máquina y los datos obtenidos graficados en el tiempo proporcionan información sobre la población de células vivas en lugar de grabaciones de unicelulares a menudo obtenidos mediante métodos técnicamente desafiantes de patch-clamp. Experimentos de influjo de calcio uso un colorante indicador de calcio, mientras que ensayos de formación de poro P2X7 dependen de bromuro de etidio se le permitiera pasar a través de la transmembrana del poro formados en concentraciones altas del agonista. Gotas de látex de color amarillo-verde (YG) se utilizan para medir fagocitosis. Antagonistas y agonistas específicos se aplican para investigar los efectos de la actividad de receptor P2X7. Individualmente, estos métodos pueden ser modificados para proporcionar datos cuantitativos sobre cualquier número de canales de calcio y los receptores purinérgicos y carroñero. Tomados en conjunto, ponen de manifiesto cómo el uso de citometría de flujo en tiempo real de células vivas es un método rápido, económico, reproducible y cuantificable para investigar la función del receptor P2X7.
El estudio de la señalización purinérgica es amplia y multifacética, que implican la farmacología, la bioquímica y la fisiología celular. Señalización purinérgica está implicado en un número infinito de procesos celulares y moleculares del cáncer y la regulación del ciclo celular para comunicaciones de la célula y biología de la célula de vástago; como tal, hay a menudo existe un potencial para modular purinérgicos para un beneficio terapéutico. De los receptores purinérgicos, receptor P2X7 ha recibido considerable atención en los últimos años debido a su potencial como una diana terapéutica para numerosas afecciones inflamatorias1. Métodos para estudiar el receptor han evolucionado y se han adaptado durante los años para facilitar esta investigación2,3,4,5. Aquí, describimos un método de citometría de flujo de células vivas para investigar las múltiples funciones de los receptores P2X7 en células progenitoras neurales adultas derivadas de la zona subventricular (SVZ) y la convolución del cerebro dentada hippocampal.
El receptor P2X7 primero fue descrito como el receptor P2Z, o los receptores de «muerte celular», como su activación con altas concentraciones de adenosina trifosfato (ATP) resultados en la formación de un gran poro transmembrana permeable a las moléculas hasta 900 Da6. Esto conduce al reordenamiento del citoesqueleto, formación de poros transmembrana y, potencialmente, apoptosis o necrosis7. Tradicionalmente, esta función de P2X7 está cuantificada por la absorción de tintes de gran peso molecular tales como YO-PRO-1 o etidio bromuro, que es fluorescente cuando se intercalan con el ADN3,8. Placa lector métodos son rápidos y permitan la ampliación de la escala, generalmente no permiten la observación de la cinética. El método aquí descrito se basa en la aceptación de etidio y permite el aumento de fluorescencia observar con el tiempo, proporcionando una mayor profundidad de la información con respecto a la velocidad de formación de poros. Desde entonces han demostrado los receptores P2X7 facilitar un número de funciones no inmunitaria, con respuestas distintas dependiendo de la exposición tiempo y agonista concentración9,10. Breve activación por concentraciones más bajas de ATP resulta en afluencia de cationes para los efectos del neurotransmisor y la señal de transducción de señales11. Mediante citometría de flujo para medir la afluencia de calcio supera los problemas asociados con los métodos engorrosos y técnicamente desafiantes, particularmente, parche de sujeción para medir las corrientes hacia adentro, que proporcionan información inestimable sobre el cambio de potencial a través de una membrana de la célula pero no permiten análisis de población2. La tercera función de los receptores P2X7 ocurre en ausencia de ATP, donde los receptores P2X7 se han demostrado para facilitar la fagocitosis en el sistema inmune y el sistema nervioso9,12,13. Los avances en técnicas de microscopía han permitido la visualización de los cambios citoesqueléticos durante el proceso de absorción, aunque análisis de cuantificación y de la población aún puede presentar un desafío.
El método de citometría de flujo de células vivas detallado aquí permite la investigación de las tres funciones principales de los receptores P2X7 en tiempo real. La inclusión de un dispositivo de módulo de tiempo en el citómetro de flujo permite el control de temperatura y agitación continua de células en suspensión. Agonista y antagonista de los estímulos pueden ser entregados dentro de un segundo, lo que permite la medición sin interrupciones cerca de la respuesta celular. Esto presenta un método rápido y simple para cuantificar reproducible función evitando el uso de múltiples sistemas de ensayo. Es importante señalar que este protocolo puede adaptarse fácilmente a cualquier tipo de célula y podría ser utilizado para examinar otros subtipos de receptores dadas la inserción de los agonistas específicos o inhibidores, dependiendo de sus propiedades.
Se presenta un protocolo detallado para el análisis de la función del receptor P2X7 en cultivos de células progenitoras neurales derivados de los nichos neurogénicos adultos. Las aplicaciones potenciales para progenitoras neurales adultas las células van desde investigaciones para fines terapéuticos, y así el método de la cultura debe ser robusta y reproducible. Hay una serie de aspectos clave en el presente Protocolo que pueda afectar la calidad de la cultura de extremo. Una vez retirado el cráneo, el cerebro no se debe secar y la disección debe realizarse tan pronto como sea posible. Particularmente con el hipocampo, cuidado extra para eliminar los vasos sanguíneos o tejido membranoso producirá rendimientos de células progenitoras superior. El proceso de disociación y trituración puede impactar fuertemente el número de esferas en una cultura; el tejido de agitación durante la incubación con tripsina-EDTA dará como resultado una solución más homogénea. El uso de un vidrio pulido de fuego pasto pipeta sobre un P1000 pipeta plástico es muy recomendable para reducir la muerte celular y mejorar la cultura resultante. Evite overtriturating. A pesar de estas precauciones, el procedimiento puede crear muchos escombros en la cultura de P0, y evitar la pérdida de las células progenitoras, lavado o la cultura de la alimentación debe evitarse hasta que las esferas se han formado.
Un número de diferencias entre el hipocampo y las culturas de la SVZ será evidentes en P0. Las culturas hippocampal rendimiento esferas menos, y estos generalmente se adhieren. Utilizar una pipeta para levantar suavemente las esferas para el paso inicial. No se observaron esferas adherentes en pasajes posteriores. Diferentes marcas de frascos de cultivo de tejidos pueden causar las esferas, esferas especialmente hipocampales, se adhieren y crecen como colonias en la parte inferior del plato. Esto no se ha encontrado para alterar cualquier resultados aguas abajo de este protocolo pero debe ser vigilado, y consistencia debe mantenerse siempre que sea posible.
Anteriores métodos utilizados para medir la función del receptor P2X7, como parche de sujeción para registrar afluencia de calcio, son lentos y laboriosos y sólo pueden proporcionar la información en una sola celda. Este protocolo presenta un método rápido y reproducible para analizar las tres funciones principales de los receptores P2X7 utilizando una máquina. Citometría de flujo de células vivas de tiempo resuelto permite el análisis de toda la población y proporciona al investigador con información sobre la cinética de la afluencia del calcio, formación de poro y función fagocítica. Además de esto, citometría de flujo se puede utilizar fácilmente como un método para evaluar patrones de expresión de marcador y análisis de la población basado en niveles de expresión de tamaño o proteína de la célula.
Al realizar estos experimentos, se pueden observar diferencias en la afluencia del calcio máxima, absorción de etidio o fagocitosis tasas entre repeticiones. Para minimizar esto, el tamaño de la esfera, condiciones de cultivo y régimen de alimentación deben ser consistente como la salud de las células tendrán un impacto significativo en los resultados obtenidos. El tiempo en el hielo también puede influir en los datos, así que garantizar todo antes de tiempo para que el tiempo en el hielo es mínimo. Asegúrese de que el tinte del indicador de calcio tiempo de carga es constante. Otro factor que puede llevar a grandes inconsistencias en las grabaciones de calcio máxima es la variación entre lotes de ATP. La preparación de las reservas de ATP es crucial, y debe evitarse el uso de lotes diferentes para los mismos experimentos. También se recomienda la comparación de viejos y nuevos lotes para asegurar que el ATP sea consistente. La efectividad de los antagonistas P2X7 también puede ser línea celular dependientes y del lote, para que optimización de concentraciones y tiempos de incubación puede ser necesario.
Cabe destacar que afluencia/eflujo de calcio es una de las funciones celulares más fundamentales y complejo y puede estar mediado por muchos receptores. La afluencia del calcio inducida por el ATP, como una medida clásica para la función de canal/poro P2X7, no puede reflejar con precisión la verdadera función de los receptores P2X7 como ATP puede también activar receptores P2Y para liberar calcio intracelular. En este caso, el bario puede ser un catión mejor utilizar en lugar de calcio ya que su flujo es unidireccional16. Para diferenciar la contribución de los receptores P2Y en afluencia del calcio, pueden utilizarse condiciones donde 1 mM EDTA o glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, ácido etilendiaminotetraacético N′ (EGTA) se añade al medio en lugar de CaCl2 K+ en este ensayo.
Este protocolo también puede ser adaptado fácilmente para adaptarse a otros tipos celulares y puede ser útil para investigar la funcionalidad de receptores de canal del ion alternativo o receptores que participan en la fagocitosis. Este método también puede ser adaptado a una máquina de citometría de flujo sin un módulo de tiempo. Como ejemplo, se pueden realizar ensayos de fagocitosis donde granos de YG se agregan 7 – 8 min antes del análisis por citometría de flujo convencional. Mantener las células a 37 ° C y continuamente remolino les. Esto no proporcionará información en tiempo real, pero las diferencias en la media de la fluorescencia final todavía informará al investigador con respecto a la funcionalidad de los receptores P2X7.
Interés en los receptores P2X7 como un fármaco objetivo21,22 o incluso como una entrega de drogas23,de la ruta24 está creciendo rápidamente, y métodos para el estudio de este enigmático receptor deben ser continuamente adaptaron y mejoraron a facilitar estos estudios. Este protocolo describe métodos que pueden utilizar para explorar la función P2X7 en células progenitoras neurales adultas, y se espera que lograr una mayor comprensión de los receptores P2X7 en los nichos neurogénicos puede conducir a avances en el tratamiento del ictus y otras lesiones isquémicas.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Maria Kasherman y Xin Huang por sus contribuciones a esta investigación. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de investigación médica de Rebecca L. Cooper y M.W., T.C.L., M.L. y T.C.L. de Nacional de salud y Consejo de investigación médica (NHMRC) de Australia (571100 y 1048082) y la Fundación Baxter ( Sydney, Australia). B.G. fue apoyado por la beca del futuro del Consejo de investigación australiano (ARC) (FT120100581), becas de proyecto de NHMRC (1048082, 1061419 y 1120095) y operativo infraestructura apoyo beca del gobierno victoriano al Instituto Florey. M.L. fue apoyado por un Charles D. Kelman, M.D. postdoctorado Premio (2010) de la Fundación Internacional de investigación retiniana (USA).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |