Sensibilité de la cellule unique, cytométrie de flux en temps réel est particulièrement adapté pour quantifier les fonctions du récepteur multimodal de cultures vivantes. À l’aide de cellules progénitrices neurales adultes, la fonction des récepteurs P2X7 a été évaluée par l’influx de calcium détectée par colorant indicateur de calcium, formation des pores transmembranaires par absorption de bromure d’éthidium et de la phagocytose en utilisant des billes de latex fluorescentes.
Cytométrie en cellules vivantes est de plus utilisé parmi les biologistes cellulaires pour quantifier les processus biologiques dans une vie culture cellulaire. Ce protocole décrit une méthode par laquelle cytométrie en cellules vivantes est étendu sur d’analyser les fonctions multiples de l’activation des récepteurs P2X7 en temps réel. À l’aide d’un module de temps installé sur un cytomètre en flux, fonctionnalité de cellules vivantes peut être évaluée et tracée sur une période donnée d’étudier la cinétique de l’influx calcique, la formation du pore transmembranaire et phagocytose. Cette méthode simple est avantageuse car tous trois fonctions canoniques du récepteur P2X7 peuvent être évaluées à l’aide d’une machine, et les données tracées au fil du temps fournissent des informations sur la population entière de cellules vivantes plutôt qu’unicellulaires enregistrements souvent obtenue à l’aide de méthodes de patch clamp techniquement difficiles. Expériences d’afflux de calcium utiliser un colorant indicateur de calcium, tandis que les essais de formation pour le pore P2X7 dépendent du bromure d’éthidium étant autorisé à passer par le transmembranaire des pores formés sur les concentrations d’agonistes haute. Billes de latex jaune-vert (YG) sont utilisées pour mesurer la phagocytose. Antagonistes et agonistes spécifiques sont appliquées pour étudier les effets de l’activité des récepteurs P2X7. Individuellement, ces méthodes peuvent être modifiés afin de fournir des données quantitatives sur n’importe quel nombre de canaux calciques et les récepteurs purinergiques et charognard. Pris ensemble, ils mettent en évidence comment l’utilisation de la cytométrie en flux de cellules vivantes en temps réel est une méthode rapide, rentable, reproductible et quantifiable pour étudier la fonction des récepteurs P2X7.
L’étude de signalisation purinergique est large et multiforme, impliquant la pharmacologie, biochimie et physiologie cellulaire. Signalisation Purinergique est impliquée dans une infinité de processus cellulaires et moléculaires, de cancer et de la régulation du cycle cellulaire aux communications de cellules et de la biologie des cellules souches ; par conséquent, il existe souvent un potentiel à moduler purinergiques de signalisation pour un bénéfice thérapeutique. Des récepteurs purinergiques, récepteur P2X7 a reçu beaucoup d’attention ces dernières années en raison de son potentiel comme une cible thérapeutique pour nombreuses affections inflammatoires1. Méthodes pour étudier les récepteurs ont évolué et été adaptée au fil des ans pour faciliter cette recherche2,3,4,5. Nous décrivons ici une méthode de cytométrie en flux de cellules vivantes pour enquêter sur les multiples fonctions des récepteurs P2X7 dans les cellules progénitrices neurales adultes provenant de la zone sous-ventriculaire (SVZ) et l’hippocampe gyrus denté.
Le récepteur P2X7 a été décrite comme le récepteur P2Z, ou le récepteur de la « mort de la cellule », comme l’activation de fortes concentrations d’adénosine triphosphate (ATP) conduit à la formation d’un gros pore transmembranaire perméable aux molécules jusqu’à 900 Da6. Cela conduit à la réorganisation du cytosquelette, la formation des pores transmembranaires et, éventuellement, l’apoptose ou nécrose7. Traditionnellement, cette fonction de P2X7 est quantifiée par l’absorption des colorants de masse moléculaire élevée comme le bromure d’éthidium ou de YO-PRO-1, qui réagissent en lorsque intercalées avec ADN3,8. Les méthodes de lecteur de plaque, qui sont rapides et permettant l’upscaling, généralement ne permettent pas pour l’observation de la cinétique. La méthode décrite ici est basée sur l’absorption d’éthidium et permet l’augmentation de fluorescence à observer au fil du temps, offrant une plus grande profondeur de l’information en ce qui concerne la vitesse de formation de pores. Récepteurs P2X7 ont depuis été montrés pour faciliter un certain nombre de fonctions non immunisés, avec des réponses distinctes selon l’exposition temps et agoniste concentration9,10. Brève activation par des concentrations plus faibles de l’ATP se traduit par l’afflux de cation aux fins de neurotransmetteur et signal transduction11. Utilisant l’écoulement cytometry pour mesurer l’influx de calcium permet de surmonter les problèmes associés aux méthodes lourdes et difficiles techniquement — particulièrement, patch de serrage pour mesurer les courants entrants qui fournissent de précieux détails quant à la différence de potentiel à travers une membrane cellulaire mais ne permettent pas pour l’analyse de population2. La troisième fonction de récepteurs P2X7 survient en l’absence de l’ATP, où les récepteurs P2X7 ont été démontrés pour faciliter la phagocytose dans le système immunitaire et le système nerveux9,12,13. Progrès dans les techniques de microscopie ont permis la visualisation des réarrangements du cytosquelette durant le processus de capture, bien que l’analyse de quantification et de la population peut encore présenter un défi.
La méthode de cytométrie de flux des cellules vivantes détaillée ici permet d’enquête sur les trois fonctions principales des récepteurs P2X7 en temps réel. L’inclusion d’un dispositif de module de temps sur le cytomètre en flux permet le contrôle de la température et agitation continuelle des cellules en suspension. Agoniste et antagoniste des stimuli peuvent être livrés en moins d’une seconde, ce qui permet la mesure quasie ininterrompue de la réponse cellulaire. Ceci présente une méthode simple et rapide pour quantifier reproductible fonction tout en évitant l’utilisation de plusieurs systèmes de dosage. Il est important de noter que ce protocole peut-être facilement être adapté pour convenir à tout type de cellule et pourrait servir à examiner les autres sous-types de récepteurs, compte tenus de l’inclusion des agonistes spécifiques ou inhibiteurs, en fonction de leurs propriétés.
Cet article présente un protocole détaillé pour l’analyse de la fonction des récepteurs P2X7 dans les cultures de cellules progénitrices neurales dérivés des niches adultes neurogènes. Les applications potentielles pour progénitrices neurales adultes cellules vont de la recherche à des fins thérapeutiques, et donc la méthode de culture doit être robustes et reproductibles. Il y a un certain nombre d’aspects essentiels au présent protocole qui peuvent influer sur la qualité de la culture de point de terminaison. Une fois retirée du crâne, le cerveau ne puissent pas sécher et la dissection doit être effectuée aussi rapidement que possible. En particulier avec l’hippocampe, des précautions supplémentaires prises pour éliminer tous les vaisseaux sanguins ou le tissu membraneux seront traduira par rendements cellules progénitrices supérieure. Le processus de dissociation et la trituration peut influer fortement sur le nombre de sphères obtenues dans une culture ; agiter le tissu pendant l’incubation avec la trypsine-EDTA se traduira par une solution plus homogène. L’utilisation d’un verre poli feu Tunney pipette sur une P1000 de pipette en plastique est fortement recommandé de réduire la mort cellulaire et améliorer la culture qui en résulte. Éviter les overtriturating. Malgré ces précautions, la procédure peut créer beaucoup de débris dans la culture de P0, et pour éviter de perdre des cellules progénitrices, de lavage ou de nourrir la culture devrait être évitée jusqu’à ce que les sphères sont formées.
Un certain nombre de différences entre l’hippocampe et cultures SVZ sera évidents à P0. Hippocampe cultures donnent moins de sphères, et ceux-ci adhèrent généralement. Utiliser un embout de la pipette pour soulever doucement les sphères pour le passage initial. Sphères adhérentes n’ont pas été observés dans les passages suivants. Différentes marques de flacons de culture de tissus peuvent provoquer les sphères, sphères particulièrement hippocampiques, d’adhérer et de grandir en tant que colonies sur le fond du plat. C’était pas pour modifier aucun résultat en aval de ce protocole, mais doit être surveillé, et cohérence devrait être maintenue lorsque c’est possible.
Méthodes précédentes utilisés pour mesurer la fonction des récepteurs P2X7, tels que les patch de serrage pour enregistrer l’influx de calcium, sont longues et laborieuses et peuvent seulement fournir des informations sur une seule cellule. Ce protocole présente une méthode rapide et reproductible pour analyser tous les trois principales fonctions des récepteurs P2X7 à l’aide d’une machine. Cytométrie en flux de cellules vivantes résolue dans le temps permettant l’analyse de l’ensemble de la population et fournit au chercheur de renseignements sur la cinétique de l’influx calcique, la formation de pores, et/ou fonction phagocytaire. En outre, cytométrie permet facilement comme une méthode d’évaluation des modèles d’expression de marqueurs et analyse de la population basée sur les niveaux d’expression de taille ou de protéines cellulaires.
Dans le cadre de ces expériences, différence d’influx calcique maximale, l’absorption d’éthidium ou taux de phagocytose peut être observée entre répétitions. Pour cela, la taille de la sphère, minimiser les conditions de culture et alimentation régime doit être respectée, comme la santé des cellules auront un impact significatif sur les résultats obtenus. Le temps sur la glace peut également influencer les données, donc s’assurer que tout est préparé en avance afin que le temps sur la glace est minime. Veiller à ce que le colorant indicateur de calcium temps de chargement est conforme. Un autre facteur qui peut mener à grandes contradictions dans les enregistrements de calcium maximale est la variation entre les lots de l’ATP. La préparation des stocks d’ATP est cruciale, et l’utilisation de lots différents pour les mêmes expériences devrait être évitée. Est également recommandé de comparer les anciens et les nouveaux lots pour garantir que l’ATP est cohérente. L’efficacité de P2X7 antagonistes peut également être dépendant de lignée cellulaire et lot, donc l’optimisation du temps d’incubation et les concentrations peut-être être nécessaire.
Il est à noter qu’afflux/flux calcique est une des fonctions cellulaires plus fondamentales et complexes et peut être médiée par les récepteurs beaucoup. L’influx de calcium induite par l’ATP, comme une mesure classique pour fonction de canal/pore P2X7, ne reflètent pas fidèlement la véritable fonction des récepteurs P2X7, comme l’ATP peut également activer les récepteurs P2Y pour libérer le calcium intracellulaire. Dans ce cas, le baryum peut être un cation mieux à utiliser au lieu du calcium comme son afflux est unidirectionnel16. Pour différencier la contribution des récepteurs P2Y à l’influx de calcium, des conditions où l’EDTA 1 mM ou éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tétraacétique (EGTA) est ajouté au milieu K+ au lieu de CaCl2 peuvent être utilisées dans ce dosage.
Ce protocole peut également être facilement adapté aux autres types de cellules et peut être utile pour étudier la fonctionnalité de récepteurs de canal ionique de rechange ou de récepteurs qui participent à la phagocytose. Cette méthode peut également être adaptée à une machine de cytométrie de flux sans un module temps. À titre d’exemple, phagocytose des essais peuvent être effectués où des perles de YG sont ajoutés 7 à 8 min avant l’analyse par cytométrie en flux classiques. Garder les cellules à 37 ° C et agiter continuellement leur. Cela ne fournira pas d’informations en temps réel, mais des différences dans la fluorescence finale moyenne informera toujours le chercheur concernant la fonctionnalité des récepteurs P2X7.
Intérêt pour les récepteurs P2X7 car un médicament cible21,22 , ou même comme une livraison de drogue itinéraire23,24 est en pleine croissance, et donc les méthodes pour étudier ce récepteur énigmatique doivent être en permanence adapté et amélioré à faciliter ces études. Ce protocole décrit les méthodes qui peuvent être utilisés pour explorer la fonction P2X7 chez des cellules progénitrices neurales adultes, et il est à espérer que parvenir à une meilleure compréhension des récepteurs P2X7 dans les niches neurogènes peut conduire à des progrès dans le traitement des accidents vasculaires cérébraux et autres lésions ischémiques.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs aimeraient remercier Maria Kasherman et Xin Huang pour leur contribution à cette recherche. Ce travail a été soutenu par des subventions de la fondation de recherche médicale Rebecca L. Cooper à M.W., T.C.L. et M.L. et à T.C.L. de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) de l’Australie (571100 et 1048082) et la fondation de bienfaisance de Baxter ( Sydney, Australie). B.G. a été soutenue par l’Australian Research Council (ARC) avenir Fellowship (FT120100581), subventions de projet du NHMRC (1048082, 1061419 et 1120095) et Infrastructure opérationnelle subvention du gouvernement victorien à l’Institut de Florey. M.L. a été soutenu par une bourse postdoctorale du Charles D. Kelman, M.D. (2010) de l’International rétinienne Research Foundation (USA).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |