질병 및 악성 세포에 대 한 엑 소 좀 유래 바이오 마커의 임상 번역은 신속 하 고 정확한 정량 방법의 결여에 의해 방해 된다. 이 보고서는 작은 부피의 혈 청 또는 혈장 샘플에서 특정 엑 소 좀을 정량화 하는 저 배율 어두운 영역 현미경 이미지의 사용을 설명 합니다.
감염 되거나 악성 세포는 빈번 하 게 더 많은 엑 소 솜을 분 비 하 고, 순환 중에 질병 관련 된 외 염색체의 상승 된 수준으로 이끌어 냅니다. 이 외 상 염색체는 질병 진단을 위한 생물 표지 자 역할을 하 고 질병 진행 및 처리 응답을 감시 하기 위하여 잠재력을가지고 있습니다. 그러나, 대부분의 엑 소 좀 분석 절차에는 약간의 분리 및 정제 단계가 필요 하며,이는 일반적으로 시간 소모적이 고 노동 집약적 이며, 따라서 임상 설정에서 제한 된 유용성 이다. 이 보고서는 별도의 분리 및 정제 단계를 거치지 않고 엑 소 솜의 외부 막에 대 한 특정 바이오 마커를 분석 하는 신속한 절차를 설명 합니다. 이 방법에서는 엑 소 좀 특이 적 항 체에 의해 슬라이드의 표면에 포획 된 후, 질병에 특이 적인 나노 입자-공액 항 체 프로브와 하이브리드 화 된다. 혼성 화 후, 대상 엑 소 좀의 풍요로 움은 결합 된 나노 입자의 저 배율 어두운 전계 현미경 (LMDFM) 이미지를 분석 하 여 결정 한다. 이 접근법은 질병에 연결 된 멤브레인 관련 엑 소 좀 바이오 마커를 분석 하기 위한 연구 및 임상 사용을 위해 용이 하 게 채택 될 수 있다.
엑 소 솜은 대부분의 세포 유형에 서 방출 되 고 다양 한 질병과 관련 된 병 리 생리학적 과정을 포함 하 여 세포 간 통신에 핵심적인 역할을 하며,이는 특정 조직 또는 세포 유형에 집 될 수 있기 때문에, 다양 한 핵 산을 함유 , 단백질 및 지질은 그들의 기원의 세포를 반영 하 고 그들의 수령인 세포1,2,4에 대 한 규제 효과를 발휘할 수 있습니다. 엑 소 솜은 종종 질병 상태에서 상승 된 수준에서 분 비 되며, 인접 하 고 먼 세포와 상호 작용할 수 있고, 타 액, 소변, 췌 장 및 담 즙을 포함 한 대부분의 체액 뿐만 아니라 순환 중에 상대적으로 높은 농도로 발견 됩니다 주스 및 기관지 폐 포 세척 액체5,6,7,9,11 인체 체액에서의이 풍부 하 고 안정성은 정보 풍부한 특성과 결합 하 여 질병 진단과 치료 모니터링을 위한 이상적인 바이오 마커를 만듭니다.
여기에는 종양 관련 돌연변이 대립 유전자를 포함 한 질병 생물 표지 자 역할을 할 수 있는 종양 특이 적 또는 선택적인 인자를 포함 하는 종양 유래 엑 소 솜 (TDEs)이 포함 됩니다. TDEs는 종양 발달 및 전이를 촉진 하 고, 항 종양 반응12를 조절 하기 위해 종양 미세 환경의 리 모델링에 참여할 수 있다. 증가 된 TDE 분 비는 대부분의 암의 일반적인 표현 형이 고 저 산소 증, 산 성 pH 및 염증을 포함 하는 종양 미세 환경의 여러 특징은 엑 소 좀 분 비를 촉진 하는 것으로 알려져 있다. 놀랍게도, 엑 소 솜을 분 비 하는 세포의 수를 감안할 때, 총 엑 소 좀 수준의 증가는 그 자체가 암 바이오 마커로 서 기능 할 수 있다. 예를 들어, 최근 연구에의 하면 담 즙 즙의 총 EV 농도가 100% 정확도7인 일반 담 관 협 착 증 환자에서 악성 및 비 악성을 판별 하는 것으로 나타났습니다. 비슷한 결과 다른 체액을 사용 하 여 연구 발견 되었습니다., 플라즈마를 포함 하 여. 그러나, 대상 변화에 대 한 잠재력 및 다른 혼동 요인으로 인해, 질병 바이오 마커로 서의 엑 소 솜을 조사 하는 대부분의 연구는 선택적으로 총 엑 소 좀 대신 TDEs와 연관 된 바이오 마커의 검출에 초점을 맞추고 있다 숫자.
엑 소 좀 바이오 마커를 임상 실습으로 번역 하는 것은, 그러나 대부분의 보고 된 엑 소 좀 분석 접근법은 시간 소모적이 고 노동 집약적 인 분리 절차 13을 필요로 하기 때문에 도전적으로 남아 있습니다. 현재 인기 있는 엑 소 좀 분리 방법에는 초 원심 분리, 밀도 구배, 크기 배제, 공 침 법, 선호도 포착 및 미세 유체 분리 접근법이 포함 됩니다. 초 원심 분리는 “금 표준” 방법 이며,이 절차는 많은 시간을 소모 하 고 엑 소 좀의 손상 및 엑 소 좀 막 군집을 초래 하 고, 엑 시에 오염 되는 몇 가지 샘플을 생산 합니다. 단백질, 지질 단백질 및 후속 분석에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인14. 대부분의 엑 소 좀은 초 원심 분리를 포함 한 일부 분리 방법은 마이크로 소포 (100~1000nm) 및 사 멸 몸체 (100~5000 nm)에서 엑 상 상 (30~150nm)을 분리할 수 없으며, 다른 메커니즘을 통해 발생 하 고 다른 기능을가지고 있기 때문에 크기 이들 그룹 들 사이에 중첩 되 고, 엑 소 좀 인구의 다양성은15이다. 엑 소 좀의 복구를 개선 하 여 엑 소 좀 회복을 향상 시키고, 엑 소 좀의 손상 및 오염을 감소 시키면서, 이러한 방법에 기반한 어떠한 분석도 그들을 렌더링 하기 위해 최적화 될 필요가 있더라도 새로운 접근법이 필요 합니다. 임상 설정에서 응용 프로그램에 대 한 번역에 적합 합니다.
몇몇 최근의 연구는 체액에서 직접 엑 소 솜을 포착 하 고 분석 하기 위해 통합 된 플랫폼을 채택 하는 것을 제안 했습니다. 이러한 방법에는 미세 유체, 동 전기적, 친화성 포획 및 엑 소 좀 분리를 위한 다양 한 방법, 그리고 전기 화학, 표면 플 렉 소 공명 및 포착 된 외 상 염색체를 검출 하는 다른 방법이 사용 됩니다. 이러한 접근법의 대부분은 복잡성, 비용, 낮은 처리량 또는 기타 문제로 인해 임상 설정에서 얼마나 실현 가능한 지는 분명 하지 않습니다.
우리는 소량의 시료만을 필요로 하는 TDEs와 같은 질병 관련 외 상 염색체를 포함 하 여 총 엑 소 솜 및 특정 엑 사의 일부 특수형의 민감하고 특이 적 정량화에 사용할 수 있는 신속 하 고 저렴 한 분석을 개발 했습니다. 임상 환경에 적합 한 간소화 된 워크플로우를 채택 합니다. 이러한 분석에서, 슬라이드는 엑 소 좀에 특이 적으로 또는 질병 특이 적인 마커 중 어느 하나를 결합 하는 항 체로 코팅 되어 작은 부피의 혈장 또는 혈 청 시료에 존재 하는 표적 외 상 염색체를 직접적으로 포착 하기 위하여 표면에 웰에 도포 된 슬라이드. 포획 된 엑 소 솜은 그 후 이러한 엑 상 염색체에 대 한 관심 바이오 마커를 인식 하는 항 체 공액 나노 입자와 하이브리드 화 되며,이는 일반적인 엑 소 좀 마커 이거나 관심 있는 엑 소 좀에 특이 적인 인자 일 수 있다. 이러한 샘플 웰의 이미지는 어두운 전계 현미경 (dfm)을 이용 하 여 포착 하 고 분석 하 여 각각의 샘플에서 포착 된 관심의 외 각에 결합 된 나노 입자 로부터 산란 된 빛을 측정 하 여도6,16,17. 특히, 낮은 배율의 DFM (LMDFM)으로 전체 샘플을 제대로 이미징 하면 사용자가 후속 이미지 분석을 위해 캡처할 필드를 직접 선택 해야 하는 경우 고배율 DFM 분석에서 발생 하는 선택 바이어스를 피할 수 있습니다. LMDFM 이미지 분석은 스크래치 및 샘플 파편을 포함 하 여 표면 불규칙에서 광산 산란 아티팩트를 적용 하지만,이 배경은 우리가 NIH 이미지 분석 프로그램에서 실행 하기 위해 개발 한 간단한 소음 감소 알고리즘을 사용 하 여 감소 될 수 있다, Https://imagej.nih.gov/ij/. 이 알고리즘은 먼저 샘플 웰의 경계를 감지 하는 데 사용 되는 입력 등고선 임계값을 적용 하 여 후속 분석을 위해 이미지의 영역을 정의 합니다. 이 윤곽 영역에 의해 정의 된 영역은 이미지의 적색, 청색 및 녹색 채널에 존재 하는 별개의 신호로 분할 되 고 청색 채널은 적색 채널에서 감산 되어 나노 로드의 표면 아티팩트 및 고르지 않은 조명 으로부터 발생 하는 신호를 제거 합니다. 신호.
본 문서는 혈장 또는 혈 청 샘플에서 전체 또는 특정 엑 소 좀 레벨을 신속 하 게 정량화 하기 위해이 분석 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다.
외 산 염은 성숙한 방출 하기 위하여 플라스마 막과 융합을 겪는 다 수의 내 산 소포를 포함 하는 다량의 내 산 소의 전문화 한 부분 집합을 생산 하는 외부의 내 시경 막의 통제 된 invaginations에서 생깁니다 세포 외 공간에 상 염색체. 이 생물 발생 통로 때문에, 엑 소 솜은 자궁내 막과 결합 하는 막 분 획과 관련 된 멤브레인 바인딩 요소 뿐만 아니라 다양 한 종류의 사이토 솔 릭 성분을 포함 하 고, 따라서 단백질, DNA의 화물를 함유 할 수 있습니다 및 기원20의 세포의 표현 형을 반영할 수 있는 다양 한 RNA 아 류 (Mrnas, 마이크로 리 나 스, 긴 비 부호화 rnas). 엑 소 솜은 대부분의 세포 유형이 아닌 대부분의 경우 분 비 되기 때문에 질병 또는 악성 세포 로부터 분 비가 증가 하 고 대부분의 체액에 축적 될 수 있으므로, 엑 소 솜은 유망한 최소한의 것으로 서 포괄적이 고 체계적인 조사의 대상이 됩니다 침략 적 수단은 특정 질병 상태를 검출 하 고 치료21에 대 한 그들의 반응을 감시 하는 것을 의미 합니다.
대부분의 현재 엑 소 좀 분석에 요구 되는 엑 소 좀의 분리는 장기간의 노동 집약적인 절차 이며, 잠재적인 의학적 관련성을 가진 엑 소 좀 관련 바이오 마커의 임상 번역을 제한 합니다. 대부분의 일반적인 분리 방법 (초 원심 분리, 크기 배제, 침전 등)은 종종 크기 범위의 중복으로 인해 마이크로 소포 (100~1000nm) 및 사 멸 몸체 (100~5000nm)에서 엑 소 솜 (30-1100nm)을 충분히 구별 하지 못하고 물리적 성질 또는 엑 소 좀 무결성15를 손상 시킬 수 있다. 새로운 접근법은 더 빠른 엑 소 좀 분석을 허용 할 수 있는 개발 중에 있지만 임상 설정에서 이러한 플랫폼을 많이 구현 하는 것이 얼마나 실현 가능한 지는 명확 하지 않습니다.
이 보고서에서는 저 배율 어두운 시야 현미경 이미지를 사용 하 여 나노 입자 기반의 고 처리량 엑 소 좀 정량화를 허용 하는 새로운 접근법을 제시 합니다. 이 방법은 엑 소 좀 정제, 고가의 전용 장비, 또는 새로운 기술 전문 지식을 필요로 하지 않으며, 따라서 대부분의 연구 및 임상 설정에서 빠른 번역에 의무가 해야 합니다. 우리의 분석 법은 강력한 선형 상관관계 (R2 = 0.99)가 존재 하기 때문에 분석 결과가 표준 곡선과 비교 될 때 특정 바이오 마커를 담지 하는 대상 엑 소 좀의 농도를 정밀 하 게 정량 하기 위해 적용 될 수 있습니다. 광학 반응과 엑 소 좀 농도 사이. 이 접근법의 실제 잠재력을 보여주기 위해, 우리는 환자 로부터 얻어진 혈 청 샘플에서 췌장암과 관련 된 엑 소 좀 바이오 마커의 농도를 정량화 하기 위해이 방법을 채용한 데이터를 제공 하 고 있다 췌장암.
LMDFM에서, 전체 샘플 웰은 사용자가 후속 이미지 분석을 위해 캡처할 샘플 필드를 직접 선택 해야 하지만, 표면에서 빛 산란 아티팩트가 적용 되는 고배율 DFM 분석에서 발견 되는 선택 바이어스를 피하기 위해 이미징 됩니다. 얼룩, 스크래치 및 샘플 파편을 포함 합니다. 이 배경은 NIH 이미지 분석 프로그램, ImageJ에서 실행 되는 우리의 DSM 잡음 감소 알고리즘을 사용 하 여 대상 엑 소 좀 파생 신호를 검출 하기 위해 감소 될 수 있지만, 주의의 동적 범위를 줄일 수 있는 이러한 아티팩트를 도입 방지 하기 위해 여전히 취해야 합니다 분석 법.
이 분석에 사용 된 재료:
1 µ L/well을 보유 한 멀티 웰 슈퍼 프로 틴 A/G 슬라이드는 Arrayit 코퍼레이션 (AGMSM192BC)에서 구입 했습니다. 나노 입자는 Nanopartz (C12 -650-50-1, 6.4 x12/mL) 로부터 얻어진 것 이다. DFM 이미지는 일관 된 조명과 1/220의 노출 시간으로 Nikon Ti 이클립스 현미경에 부착 된 Nikon DiR2 디지털 카메라로 촬영 되었습니다. 본 연구에서 사용 된 PANC-1 세포 주는 미국 형 배양 컬렉션에서 구입 하였다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 주로 NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 및 R21Al126361)에 의해 제공 되는 연구 기금에 의해 지원 되었다, 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ABRC) 젊은 조사원 상.
Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |