Cellen gratis Protein syntese (CFPS) har dukket opp som en teknologi som har låst opp en rekke nye muligheter for protein produksjon, funksjonell genomforskning, metabolske engineering og mer i de siste 50 år^1,2. Sammenlignet med standard i vivo protein uttrykk plattformer, CFPS gir tre viktige fordeler: 1) cellen-fri natur plattformen gjør produksjonen av proteiner som ville være potensielt giftig eller utenlandske til celle^{3,4 ,5,6}; 2) inaktivering av genomisk DNA og innføring av en mal DNA koding gene(s) rundt kanalen alle systemisk energien i reaksjonen til produksjon av protein(s) steder. og 3) den åpne naturen plattformen gjør det mulig å endre og overvåke reaksjonen forhold og komposisjon i sanntid^7,8. Denne direkte tilgang til reaksjonen støtter augmentation av biologiske systemer med utvidet kjemikalier og redoks forholdene for produksjon av romanen proteiner og tuning av metabolske prosesser^{2,9, 10}. direkte tilgang gir også brukeren å kombinere CFPS reaksjon med aktivitet analyser i et enkelt-potten system for rask utformingen-bygge-test sykluser¹¹. Kapasitet til å utføre CFPS reaksjonen i små dråper eller på papir-baserte enheter videre støtter høy gjennomstrømming oppdagelsen innsats og rask prototyping^{12,13,14,15 ,16}. Disse fordelene og plug and play natur systemet, CFPS har unikt aktivert en rekke bioteknologi programmer som produksjonen av proteiner som er vanskelige å solubly express i vivo^{17, 18,19,20}, påvisning av sykdom^21,22,23, på etterspørsel biomanufacturing^{18,24 ,25,26,27}, og utdanning^28,29, som viser fleksibilitet og nytten av celle-fri plattformen.

CFPS systemer kan genereres fra en rekke råolje lysates fra både prokaryotic og eukaryotic linjer. Dette gir forskjellige alternativer i systemet av valg, hver har fordeler og ulemper avhengig av anvendelsen av interesse. CFPS systemer også variere i Forberedelsestid, kostnader og produktivitet. De benyttes vanligvis celle ekstrakter produseres fra hvetespirer, kanin retikulocytt, insekt celler og Escherichia coli celler, sistnevnte er den mest kostnadseffektive hittil mens de høyeste volumetriske gir protein³⁰ . Mens andre CFPS systemer kan være fordelaktig for medfødte post-translasjonell modifikasjon maskiner, nye programmer ved hjelp av E. coli-baserte maskiner kan bygge bro ved å generere site-specifically fosforylert og Glycosylated proteiner på etterspørsel,^31,,^32,,^33,,^34,,³⁵.

CFPS reaksjoner kan kjøres i enten bakst, kontinuerlig-utveksling celle-free (CECF) eller kontinuerlig flyt celle-fritt (CFCF) format. Batch-format er et lukket system som reaksjon levetid er begrenset på grunn av avtagende mengder reaktantene og akkumulering av hemmende biprodukter av reaksjonen. CECF og CFCF øke levetiden til reaksjonen og føre dermed til økt volumetriske protein gir sammenlignet med satsvise reaksjonen. Dette gjøres ved at biprodukter av proteinsyntese fjernes fra reaksjonen fartøyet mens nye reaktantene leveres i løpet av reaksjon². Når det gjelder CFCF, kan protein rundt også fjernes fra reaksjon kammer, i CECF, protein av interesse i reaksjon kammeret består av et halvt gjennomtrengelig membran^36,37. Disse metodene er spesielt nyttig i å overvinne dårlig volumetriske gir vanskelig-å-uttrykker proteiner av interesse^{38,39,40,41,42, 43}. Utfordringene med å implementere CECF og CFCF tilnærminger er at 1) mens de resultere i mer effektiv bruk av bio maskiner ansvarlig for transkripsjon og oversettelse, de krever spesielt større mengder reagenser som øker totalkostnad og 2) de krever mer komplekse reaksjon oppsett og spesialisert utstyr forhold til satsvise format⁴⁴. For å sikre tilgjengelighet for nye brukere, beskrevet protokollene heri fokus på batch-format på reaksjon mengder 15 µL med konkrete anbefalinger for å øke volumet reaksjon til milliliter skala.

Metodene presenteres her at ikke-eksperter med grunnleggende laboratorium ferdigheter (for eksempel studentene) kan implementere cellevekst, ekstra forberedelse og satsvis format reaksjon installasjon for en E. coli-basert CFPS system. Denne tilnærmingen er kostnadseffektiv sammenlignet kommersielt tilgjengelig kits uten å ofre enkel kit-baserte reaksjon oppsett. Videre lar denne tilnærmingen programmer i laboratoriet, og i feltet. Når beslutter å implementere CFPS, bør nye brukere grundig vurdere effekten av konvensjonelle protein uttrykk for oppstart investeringer, som CFPS ikke kan bli bedre i alle tilfeller. CFPS metodene beskrevet her at brukeren direkte implementere en rekke programmer, inkludert funksjonell genomforskning, høy gjennomstrømming testing, produksjonen av proteiner som er vanskelige for i vivo uttrykk, i tillegg til feltet programmer inkludert biosensors og pedagogisk kits for syntetisk biologi. Tilleggsprogrammer som metabolske engineering, tuning av protein uttrykk forhold, sykdom gjenkjenning og skalere opp bruke CECF eller CFCF er fortsatt mulig, men kan kreve erfaring med CFPS plattform for videre modifikasjon av reaksjon forhold. Våre metoder kombinere vekst i beriket media og forvirret flasker, med relativt rask og reproduserbar metoder for cellen lysis gjennom sonication, etterfulgt av en forenklet CFPS reaksjon oppsett som utnytter optimalisert premixes⁴⁵. Mens metodene mobilnettet vekst har blitt noe standardisert innen dette feltet, varierer metoder for cellen lysis mye. I tillegg til sonication omfatter felles lysis metoder bruk av en fransk trykk, en homogenizer, perle beaters, eller lysozyme og andre biokjemiske og fysiske avbrudd metoder^{46,47,48, 49}. bruke våre metoder, ca 2 mL olje celle pakke hentes per 1 L celler. Dette antallet av cellen ekstrakt kan støtte fire hundre 15 µL CFPS reaksjoner, hver produserende ~ 900 µg/mL reporter sfGFP protein fra malen plasmider pJL1-sfGFP. Denne metoden koster $0.021/µg av sfGFP produsert ($.019/µL av reaksjonen), unntatt arbeidskraft og utstyret (supplerende figur 1). Denne metoden starter fra scratch, kan implementeres i 4 dager ved en enkelt person, og gjenta CFPS reaksjoner kan fullføres innen timer (figur 1). I tillegg kan protokollen skaleres i volumet for større batcher av forberedelse av reagenser etter brukerens behov. Viktigere, kan protokollen presenteres her implementeres av laboratoriet trent ikke-eksperter som studenter, som det bare krever grunnleggende laboratorium ferdigheter. Fremgangsmåtene nedenfor og på videoen har blitt spesielt utviklet for å forbedre tilgjengeligheten av E. coli CFPS plattform for bred bruk.