Summary

Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

Published: January 04, 2019
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Summary

Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.

Abstract

Ce manuscrit décrit une méthode simple et reproductible pour effectuer un test de la phagocytose. La première partie de cette méthode consiste à construire un vecteur animal-SUMO-EGFP (SUMO = petite ubiquitin-comme modificateur) et exprimant accrue de protéine de fluorescence verte (EGFP) chez Escherichia coli (BL21DE). Exprimant EGFP e. coli est co-incubée avec macrophages pendant 1 h à 37 ° C ; le groupe témoin négatif est incubé sur glace pendant le même laps de temps. Ensuite, les macrophages sont prêts pour évaluation. Les avantages de cette technique sont ses étapes simples et clairs, et phagocytose peut être mesurée par les deux flux cytomètre et fluorescence microscope. Les e. coli exprimant EGFP sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte même après que les macrophages sont fixés avec du paraformaldéhyde. Cette méthode est non seulement approprié pour l’évaluation de lignées de cellules macrophages ou macrophages primaires in vitro mais convient également pour l’évaluation des granulocytes et macrophages phagocytose dans les cellules mononucléaires de sang périphérique. Les résultats montrent que la capacité phagocytaire des macrophages péritonéaux de jeunes souris (huit semaines) est supérieure à celui des macrophages de souris âgées de (16 mois). En résumé, cette méthode mesure phagocytose du macrophage et est adaptée pour l’étude de la fonction du système immunitaire inné.

Introduction

Tests de phagocytose des macrophages sont souvent utilisés pour étudier le système immunitaire inné. La réponse immunitaire innée peut indiquer la susceptibilité à l’infection. Lignées de cellules macrophages sont largement utilisées dans les études d’immunologie. Toutefois, le passage prolongé peut causer la perte de gènes et compromis les fonctions immunitaires dans ces lignées de cellules. Ainsi, les macrophages péritonéaux primaires font l’objet idéal permettant d’étudier la fonction des cellules1.

Bien que la réponse immunitaire innée pensait être intacte dans le corps âgé, la capacité phagocytaire peut diminuer par rapport à que dans le jeune corps2,3. Ici, nous allons démontrer une méthode pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux d’young (huit semaines) et les personnes âgées (16 mois) souris aide exprimant EGFP e. coli, qui est pratique, rapide et rentable.

L’utilisation d’une souche exprimant EGFP e. coli est un des avantages de ce test, car ces bactéries sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte, même après que les macrophages sont fixés par la paraformaldéhyde à 4 % (p/v). En outre, en utilisant l’ exprimant EGFP e. coli, les chercheurs n’ont pas besoin de coloration plus loin après la phagocytose, qui fait gagner du temps. En outre, les macrophages sont immunoresponsive pour l’antigène de surface d’e. coli , ce e. coli davantage adapté pour le dosage de la phagocytose que d’utiliser les champignons exprimant EGFP ou perles marqué à la fluorescéine.

Avec exprimant EGFP e. coli, un dosage de phagocytose peut être facilement réalisé en 2 h et mesuré par les deux microscopie écoulement cytometry et fluorescence, selon le but du chercheur. Étant donné que cette méthode permet de mesurer directement la capacité phagocytaire, les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.

Cette méthode a également été validée dans une lignée de cellules RAW264.7 et des cellules mononucléaires de sang périphérique humain4. Le texte ci-dessous fournit les instructions détaillées pour la réalisation de cet essai et met en évidence les étapes critiques que les chercheurs peuvent modifier pour répondre aux besoins de leurs expériences.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvées par le Comité emploi de Dalian Medical University et animalier. Seize mois (avec un poids de 30-35 g) et huit semaines (20-25 g) SPF (spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes) C57BL/6 des souris mâles ont été obtenues du centre animaux SPF de l’université médicale de Dalian. Toutes les souris étaient gar…

Representative Results

Le vecteur de pET-SUMO utilise un modificateur d’ubiquitin-comme petit pour permettre l’expression des protéines natives dans le e. coli. Fusion de SUMO peut considérablement améliorer la solubilité EGFP, lui permettant d’être détecté facilement. Si l’expression EGFP est induite avec succès en lactose, vous peuvent observer des colonies vertes dans l’obscurité (Figure 1 a). Les points verts, qui représentent l’ exprimant EGFP …

Discussion

Les étapes décrites dans le présent protocole sont assez simples et clairs. Une des étapes essentielles est d’induire l’expression EGFP sur e. coli. Habituellement, lorsqu’un gène d’eucaryotes, comme EGFP, est prévu d’exprimer chez les procaryotes comme e. coli, il y a un risque que la protéine se forment des agrégats inactifs (corps d’inclusion), qui modifie la structure native et l’activité de la protéine. En utilisant le vecteur animal-SUMO et construire le plasmide de pET-SUM…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 31800046) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Liaoning (no 20170540262) prise en charge de ce travail. Ce travail a été accompli dans les laboratoires du centre de recherche scientifique à l’Université deuxième hôpital de Dalian Medical. Les auteurs aimeraient remercier Xiao-Lin Sang pour son aide avec la cytométrie en flux, ainsi Bo Qu et Dong-Chuan Yang pour leur aide dans la production de la vidéo.

Materials

BD FACSCanto II Flow cytometer BD Biosciences
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody Biolegend Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system Invitrogen K300-01
Custom Gene Synthesis Service Takara Biotech.
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS Biolegend Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope Leica Microsystems
PE Rat IgG2a, κ-isotype control Biolegend Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution AAT Bioquest Cat23125
Thioglycollate medium Sigma-Aldrich T9032

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Zhang , Y., Wang, G., Lu, J., Xu, L., Xiong, J. Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis. J. Vis. Exp. (143), e58751, doi:10.3791/58751 (2019).

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