Gibbérelline Perception capteur 1 (GPS1) est le premier Förster resonance energy axée sur le transfert biocapteur pour mesurer les niveaux cellulaires de phytohormones gibbérelline avec une haute résolution spatio-temporelle. Ce protocole des rapports sur la méthode de visualiser et de quantifier les niveaux de gibbérelline cellulaires utilisant le biocapteur nlsGPS1 génétiquement encodé dans Arabidopsis hypocotyles et radicelles.
La gibbérelline phytohormone (GA) est une petite molécule signalisation mobile qui joue un rôle clé dans la germination des graines, l’élongation cellulaire et les transitions du développement chez les plantes. Gibbérelline Perception capteur 1 (GPS1) est le premier transfert d’énergie de résonance Förster (FRET)-base de biocapteur qui permet de contrôler les concentrations cellulaires GA in vivo. En mesurant un facteur d’émission de fluorescence du nucléaire localisé-GPS1 (nlsGPS1), la cartographie spatio-temporelle des gradients de GA endogène et exogène fournis dans types de tissus différents est réalisable à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit comment nlsGPS1 les ratios d’émission en trois expériences exemple d’image : équilibre, traitements de4 (GA4) avant et après la gibbérelline exogène A et au fil du temps un traitement. Nous fournissons également des méthodes pour analyser les rapports d’émission nlsGPS1 aide de Fidji et un logiciel de visualisation et d’analyse commerciale à balayage tridimensionnelle (3D) et expliquer les limites et les pièges susceptibles d’utiliser nlsGPS1 pour quantifier les niveaux de la gibbérelline.
Hormones végétales jouent un rôle fondamental dans la croissance des plantes et le développement. Ces molécules de signalisation petites, mobiles sont généralement réglementées à plusieurs niveaux, tels que la biosynthèse, catabolisme et courte et longue distance transport1,2,3,4. La compréhension des voies de signalisation de l’hormone et réponses transcriptionnelles en aval a aiguisé au fil des ans. Toutefois, pour lier les diverses réponses cellulaires des voies de signalisation hormone avec les entrées réglementaires, mise en scène des distributions de l’hormone, nous exigeons une quantification spatio-temporelle des niveaux d’hormones à l’échelle cellulaire. Biocapteurs axée sur la frette qui peuvent détecter des phytohormones peuvent avancer la capacité des scientifiques à quantifier les niveaux d’hormones à l’échelle cellulaire. Biocapteurs axée sur la frette se composent d’une paire de frette (protéines fluorescentes donneur et accepteur) liée à un domaine sensoriel qui se lie à un ligand spécifique ou répond à un stimulus biologique. Pour les biocapteurs de petites molécules, liaison du ligand déclenche un changement conformationnel du domaine sensoriel qui se traduit par un changement de distance et/ou d’orientation entre les deux protéines fluorescentes de la paire de frette. Une analyse logométrique d’un biocapteur FRET s’effectue en excitant le donateur et le coefficient d’émission de la fluorescence de l’accepteur de mesure plus de donateurs5,6. Liaison du ligand est détectable comme un changement dans cette émission ratio7.
Récemment, nous avons développé un biocapteur axée sur la frette pour l’hormone végétale GA. gaz sont une classe d’hormones qui peuvent favoriser la germination des graines, l’élongation cellulaire et la transition du développement de végétative aux phases de floraison. Le biocapteur nlsGPS1 est nucléaire localisé et fournit des aperçus spatio-temporelle de la dynamique de GA dans les tissus végétaux divers. Dans les cellules de l’Arabidopsis , GA se lie aux récepteurs solubles, indépendante de la gibbérelline nain (GID), et le complexe provoque la dégradation des protéines DELLA qui agissent comme des régulateurs négatifs du GA2de signalisation. Le domaine sensoriel GA de nlsGPS1 se compose du récepteur Arabidopsis GA (AtGID1C) lié à une troncature 74-amino acide d’une protéine DELLA (AtGAI) et une paire de frette consistant en amélioré des variantes de dimérisation de Cerulean comme la protéine fluorescente de donateurs et Aphrodite (Vénus sur une codon diversifiés) comme l’accepteur protéine fluorescente8. Le biocapteur de nlsGPS1 est un capteur de haute affinité pour le bioactive GA4 (Kd = 24 nM pour GA4) et il peut être utilisé dans divers types de tissus pour cartographier et quantifier des gradients de GA. Pour éviter une interprétation erronée des niveaux Arabidopsis GA in vivo, nous avons également développé une variante qui ne répondent pluse de nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) à utiliser comme contrôle négatif. La protéine nlsGPS1-NR porte dans la poche de GA-fixation des mutations qui perturbent la liaison du GA et mutations de la protéine DELLA qui perturbent l’interaction avec les récepteurs GID protéines7,9. Modèles de rapport d’émission ou des changements observés chez les nlsGPS1 nlsGPS1-NR lignées et peuvent être considéré comme objets non directement liés aux événements de GA-liaison. Il est également important de noter que la liaison nlsGPS1 à GA4 n’est pas rapidement réversible, et donc, les rapports d’émission nlsGPS1 cellulaire devraient être interprétés comme représentant la plus forte concentration récente de GA dans un noyau donné plutôt que le temps réel niveaux d’équilibre. En conséquence, une analyse de la baisse du niveau GA n’est pas possible avec nlsGPS1.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé d’utilisation d’un biocapteur nlsGPS1 dans les cellules de la plante modèle Arabidopsis, en utilisant des approches axées sur l’imagerie confocale à une haute résolution. Le protocole fournit des informations sur les racines des plantes d’imagerie et des hypocotyles tant à l’état stable au fil du temps-cours. Le capteur nlsGPS1 pourrait potentiellement être utilisé dans divers types de tissus, ainsi qu’entre les espèces de plantes, de cartographier et de quantifier les distributions de GA.
Le nlsGPS1 de biocapteur axée sur la frette GA fournit une méthode quantitative pour signaler et de mesurer les gradients hormone GA plantes multicellulaires. Axée sur la frette biocapteurs peuvent de quantifier la dynamique avec une meilleure résolution spatio-temporelle sur détection directe par spectrométrie de masse et une mesure indirecte de transcriptional reporters ou signalisation-protéine-dégradation-méthodes basées sur les12, 13. Une imagerie cellulaire dans divers types de tissus peut donner un aperçu significatif de GA biologie et étincelle de nouvelles hypothèses concernant la régulation et la fonction des accumulations de GA dans un contexte multicellulaire. Par exemple, suivre les changements dans le biocapteur nlsGPS1 GA spécifique biosynthétique, catabolique et des mutants de transport, ainsi que durant les perturbations induites spatio-temporelle, peut être très instructif pour tester plus précisément comment les gradients de GA sont établies en la racine et les racines de l’adresse de cellule réponses aux gradients de GA. Le capteur peut être utilisé chez d’autres espèces de modèle et de la culture pour tester la conservation des mécanismes qui régissent le contrôle médiée par les GA de la germination des graines, l’élongation cellulaire et la floraison.
Les étapes critiques de l’imagerie axée sur la frette du biocapteur nlsGPS1 sont que 1) les pixels ne devraient pas être saturés lors de l’analyse quantitative de la frette, 2) imageries paramètres comme « détecteur gain » doivent être maintenus constantes pour l’émission du donneur (DxDm) et les acquisitions d’accepteur d’émission (DxAm), les 3) lignes de nlsGPS1-NR de contrôle doivent être utilisés pour exclure des artefacts et 4) échantillons devraient être prêts à réduire au minimum la dérive et les questions de changement de focale. En outre, les conditions environnementales dans lesquelles sont cultivés les échantillons sont importantes contrôler les niveaux de GA étant sensibles aux conditions environnementales telles que l’autonomie et de l’intensité lumineuse14,15,16 ,17. Une clé de la limitation de ce type d’analyse est qu’il faut pour l’imagerie en raison de l’augmentation du bruit inhérent à l’imagerie ratiométrique un rapport signal sur bruit élevé. Ainsi, l’imagerie nlsGPS1 ne sera pas utile pour les tissus et les organes qui ne se prêtent pas à la microscopie de fluorescence de ratiométrique utilisant des protéines fluorescentes cyan et jaunes — par exemple, les tissus plus profonds où les protéines fluorescentes sont mal détectés. En revanche, ratiométrique lectures sont souvent préférées sur intensiometric lectures, parce qu’un contrôle interne est utile pour éliminer les artefacts découlant des changements dans l’expression de biocapteur, stabilité, luminosité ou la détectabilité dans une cellule donnée, tissu , ou d’une condition. Par exemple, vous inquiétez pas l’imagerie biocapteur et analyses de l’image ont également été utilisés pour étudier une variété de ligands dans une variété de tissus5,6,18,19,20,. Des expériences d’imagerie et des analyses d’image rapportés ici sont modifiables en fonction de nouvelles méthodes d’imagerie, telles que la microscopie de nappe de lumière, qui pourrait donner des idées nouvelles dans, par exemple, plus profonde racine-types de tissus.
Le biocapteur de première génération nlsGPS1 est un capteur de haute affinité qui fournit une carte à haute résolution des gradients de GA qui peut également signaler une augmentation intracellulaire GA suite à des traitements de GA exogènes. Une des limitations actuelles de nlsGPS1 est que le capteur n’est pas rapidement réversible et, ainsi, rapporte pas sur les niveaux de GA stationnaire mais, probablement, sur la concentration dans la solution GA récente maximale d’intérêt. Le taux de rotation précis pour le capteur est également pas connu et ceci, combiné avec faible réversibilité, s’oppose à une détection des déplétions de GA endogènes qui pourrait se produire dans une minutes à un peu d’heures dans certains types de tissus. Il est également important de noter que nlsGPS1 a une forte affinité pour GA4 (Kd = 24 nM) par rapport à d’autres formes de GA (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) lorsque l’imagerie autre gaz bioactive 7. les générations futures des biocapteurs GA peuvent être conçues pour augmenter la réversibilité tout en conservant une affinité élevée ou présentent des spécificités différentes pour les différents précurseurs, bioactive, ou catabolite gaz.
The authors have nothing to disclose.
Cet ouvrage a reçu un financement depuis le Conseil européen de recherche (CER) en vertu du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (subvention contrat n ° 759282).
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH70 % , and keep at -20°C |
sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
Agar plant, 1kg | Melford | P1001 | |
Microscope slide ground edges, 76mm x 26mm, 1.0mm to 1.2mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
Cover slip No.1 1/2 glass 22mm x 22mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
Luer-slip Syringe 2o ml | Fisher Scientific | 10785126 | |
3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
Potassium Hydroxide, 500g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
Scissors, 125mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
Fiji | image analysis software | ||
OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |