sineup 是一种合成反义非编码 rna, 它包含一个结合域 (bd) 和一个效应域 (ed), 并向上调节目标 mrna 的翻译。在这里, 我们描述了在培养细胞系中检测 sineup 的方法, 分析了他们的翻译促进活性的西方印迹和半自动高通量成像系统。
靶蛋白增强不仅对生物过程的研究具有重要意义, 而且对治疗和生物技术的应用也具有重要意义。在这里, 我们提出了一种方法, 有选择地提高蛋白质表达所需的基因在培养细胞中的合成反义非编码 rna 称为 sineup。这种基因表达的正控制是在转录后水平, 并由倒置短的混合核元件 (sine) 重复在 sineup 的3端, 包括其效应域 (ed)。sineup 可以通过其结合域 (bd) 与任何蛋白质编码 mrna 的选择结合, 该区域旨在补充 5-博未翻译区域 (5-博 utr) 内和 mrna 起始密码子周围的序列。以这种方式设计的目标特异性 sineup 被转染到培养的细胞, 蛋白质和 rna 被提取用于下游分析, 通常是转染后24-48。用西方印迹分析检测 sineup 诱导的蛋白质调节, 并利用实时定量逆转录酶链反应技术检测 rna 表达。我们观察到 bd 设计对于实现最佳的 sineup 活动至关重要, 建议根据目标 mrna 的起始密码子测试不同的 bd 大小和位置。因此, 我们在这里描述了一种基于荧光检测的半自动高通量成像方法, 该方法可以针对与绿色荧光蛋白 (gfp) 融合的 mrna。sineup 特别增强细胞正常生理范围内的翻译, 而不改变目标转录水平。这种方法已成功地应用于一系列内源性和外源性目标, 在各种各样的人类、小鼠和昆虫细胞系以及体内系统中使用。此外, 据报道, sineup 增加了抗体的产生, 并作为 rna 治疗单倍体基因不足的药物。sineup 的多功能和模块化特性使其成为特定基因平移控制的合适工具。
在后基因组时代, 由于下一代测序技术 1、2、3和基因编辑工具。这类成绩单以前被认为是 “转录垃圾”, 现在被确定为基因监管的关键参与者。反义转录报告调节染色质和控制稳定性和表达他们的同源蛋白编码感觉 mrna4,5。在大多数情况下, 这种监管模式是负面的, 反义记录通过 rna-rna 相互作用6,7使感觉对应的沉默。这种自然反义转录的特征已被用来降低所需的基因的形式合成小干扰 rna (sirna), 微 rna (mirna), 和反义寡核苷酸 (aso)8,9,10 ,11为有针对性的基因向上调节留下了技术空白。
一项有趣的研究改变了反义 rna 场的观点, 证明了uchl1 (泛素 c-末端水解酶 l1) 和uxt (泛素表达的转录) 基因的反义长非编码 rna (as lnrna)在12岁小鼠转录后水平上积极调节它们同源意义 mrna 的翻译.这些 as lna 的5核末端与其相应的感觉记录的 5-未翻译区域 (5、utr) 中的几个碱基重叠, 而非重叠的3端包含属于短插层核的反转换子的倒置重复元素 (sine) 系列。有趣的是, 我们发现, 这种平移向上调节背后的主要驱动力是嵌入式 sine 重复, 它并不局限于鼠标 sine 重复。人的 alu 重复 as ncrna 还增强了目标感知 mrna 的翻译, 强化了一类新型的 sine 驱动的监管反义非编码 rna 的理念, 适当地命名为 sinp13.最近的研究表明, 天然 sinep 的潜力被保存在合成 sinep 中, 专门针对各种内源基因和外源基因14,15.sineup 有两个重要特征: 第一, “结合域” (bd), 它通常是 5-p 末端区域, 它是对包含蛋白质编码 mrna 的主要起始密码子的序列的补充, 其次是 “效应域” (ed), 因为它包含了倒置重复的 sine, 这是 sineup 函数14的先决条件 (图 1)。sineup 可以定制, 以设计专门针对首选基因的 bd。然后, 可以利用这一点来剖析参与生物途径的特定基因的功能, 作为传统 mrna 过度表达策略的更好替代品。此外, 这种多功能工具可用于促进抗体的产生, 并作为一种药物, 以治疗单倍体不足的疾病引起的功能蛋白剂量不足 16,17, 18, 19,20,21。
sineup 技术的优势是多方面的。它不会改变目标在转录水平上的表达。较长的 bd 为 sineup 提供了更具体的特性, 同时不会诱导依赖 dsrna 的应激反应15。蛋白质诱导保持在细胞的正常生理范围内, 防止任何有害影响, 由于异常或过度的蛋白质表达。sineup 与各种各样的老鼠、人和仓鼠培养的细胞系兼容, 例如 hek29kht17、hepg2、hela、cho、mn9d 和更多的12、13、14、15、18 ,19。sineup 可以有效地靶向内源性基因、短暂过度表达的基因和 flag-tor 标记或荧光融合基因, 从而消除 14,18基因特异性抗体的需要。基本的 sinup 分析需要常规的细胞培养、转染、十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page)、实时定量逆转录聚合酶链反应 (qrt-pcr) 仪器和设置, 以及专业知识可以在很短的时间内获得。
在这里, 我们描述了一种针对具有合成 sineup 的基因的方法, 以提高翻译的水平, 这一效果与其他技术 (如 rna 干扰9和 aso gapmers11、22、23) 相反。一种广泛使用的 rna 引导基因激活方法是聚集定期间隔的短棕榈重复激活 (crispra), 其中基因表达在转录水平24触发。这种方法虽然简单、快速, 但需要多个单一引导 rna (sgrna) 针对同一基因, 以获得更高的效率, 从而增加了离目标结合25的机会。此外, crispra 系统的关键酶, 催化死的 crispr 相关蛋白 9 (dcas9) 具有较低的结合特异性和针对双向启动子区域的 sgrna 可以非特异性向上调节附近的基因25。相反, sineup 结合到具有高特异性的单个结合区域的 mrna, 并且不会影响附近基因的表达。我们讨论了 sineup 设计、转染、蛋白质和 rna 表达分析所涉及的基本步骤。此外, 我们还提供了一个半自动、高通量的成像系统, 可同时筛选多个 sineup, 这对于检测最佳的 sineup 非常有用。
我们在这里描述了一种协议, 通过一种名为 sineup 的含有 sine 的非编码 rna 来专门提高目标 mrna 的蛋白质生产。作为一个有代表性的例子, 最佳合成 sinup-gfp 被证明可以通过西方印迹分析来调节 gfp mrna 的2.6 倍的翻译。
设计最佳 bd 对于确保 sinup 的特异性和有效性 (蛋白质向上调节的程度) 至关重要。此前, 我们通过西方印迹分析15 筛选了17 bd sineup-gfp, 发现最佳 bd 与 gfp mrna 的 aug-kozak 序列重叠, 但与其他 mrna 可能不是这样, 应针对每个病例进行验证。另一个独立小组也使用不同的方法对bd 进行了筛查31。由于筛选许多 bd 可能非常耗时和繁琐, 因此我们在此处引入了一种高通量的 sineup 检测方法。该方法测量了与对照载体经细胞相比, sineup 转染细胞 gfp 综合密度的相对变化。为了确保培养板的特定井中的细胞被均匀地转染, transfected 信号不只集中在井的某一区域, 在步骤2.1 中, 将细胞均匀地分布在井中是非常重要的。为此, 在清洁的长凳内播种细胞后, 轻轻摇晃板10次左右 (↑), 并在开始孵育前在 5% co 2 孵化器中重复 。
另一个关键步骤是在步骤3.3 中计算蛋白质浓度。这里的误判可能会导致在西方印迹分析过程中加载错误数量的蛋白质, 从而阻止检测到一些弱 sineup 在蛋白质表达方面的微小变化, 或因超载而产生假阳性。建议每次都重新准备蛋白质标准曲线, 确保在3.3.3 的步骤中测量同等数量的标准和蛋白质样本。这里描述的协议侧重于 sineup-gfp, 但西方印迹分析可用于任何感兴趣的目标 mrna。应针对每个目标优化抗体的培养时间和浓度, 以获得最佳效果。
sineup 的一个独特之处在于靶-mrna 表达水平不受影响。用 dnase 处理 rna 是非常重要的, 以避免 qrt-pcr 检测转染的 sineup 和基因组 dna。应使用 qrt-pcr 检测 sinup rna 和靶点 mrna 表达, 以确认转染和 sineup 活性的成功。sineup 包含一个 sine 序列, 这在人类和小鼠基因组中都是丰富的。为了避免非特异性检测的 sine 序列, 不建议将 qrt-pcr 引物设计到 sine 序列中。
在这个协议中, 我们使用了人类细胞系, 但 sineup 在来自 12个、13、14、18、19的几个不同物种的一些细胞系中是有效的。细胞培养和转染条件可以根据不同的细胞系进行修改, 只要这些细胞保持 sinup 载体的转染效率。此外, 可以采用 rna 提取、cdna 合成和蛋白质浓度检查的替代方法, 因为它们保留了 qrt-pcr 和西方印迹分析所需的 rna 和蛋白质质量。虽然我们使用了一种特定的高通量微井细胞仪, 可以在整个井中检测 gfp 荧光, 但其他具有类似检测范围的细胞仪可以使用31。需要注意的是, 如果整个井的细胞分布和转染相等, 那么就没有必要对整个井进行 transfection 荧光扫描: 一口井面积的一半或四分之一可能足以根据实验来识别 sineuup 效应的技能。
通过建立高通量 sineup 检测协议, 可以同时筛选培养细胞中针对给定 mrna 的多个 bd。这一点很重要, 因为关于 bd 最佳目标的规则仍不清楚。这种多重筛选系统允许针对不同的基因对许多 sineup 进行大规模测试, 例如, 这对于针对特定信号通路中涉及的多个基因非常有用。此外, 它还可用于扩大针对多个 mrna 的有效 sineup 的搜索, 围绕 aug-kozak 区域设计不同的 sineup bds (参见图 1), 与 gfp mrna 融合的全长目标 mrna (5-7l uts-3e-eux utr)在培养的细胞中寻找最佳的 sineup, 然后在培养的细胞和体内模型动物中测试 bd 候选物质, 从人类和小鼠到其他动植物物种。
这种筛选方案非常快。我们不需要修复和收集细胞, 只需要将活细胞培养板放置在成像仪器中。我们建议使用这种高通量筛选协议来选择最佳的 sineup bd, 并通过西方印迹分析来评估潜在的候选项。因此, 选择具有最佳 bds 的候选候选项可用于增加抗体产生 18、19、21.目前, rna 治疗领域正在急剧增长。例如, sirna、aso、mrna 和 crispr 疗法被广泛用于控制各自目标9、32的 mrna 表达。在此背景下, sineup 尚处于起步阶段, 但迄今为止, 所研究的 sineup 都没有改变目标 mrna 的表达。此外, sineup 不编辑目标 mrna, 而只是上调 mrna 的翻译。此外, 单倍性不足引起的功能丧失疾病可通过 sineup 治疗的目标, 实现2倍诱导的缺陷蛋白17,33。虽然非目标效应需要进一步研究, 但 sineup 有可能并专门针对一个单一的、表达的 mrna, 并与 bd 互补的序列。
这种高通量协议的一个局限性是, 它不适合在体内小鼠模型中筛选 sineup 的 bds, 因为该协议只测量 gfp 集成强度。由于 sineup 是在转录后起作用的自然反义 incrna, 当目标 mrna 在细胞或组织样本中缺失时, 它们不能被应用。
然而, sineup 可用于功能增益研究, 提高抗体的产生, 并作为 rna 疗法, 在1.5-3.0倍的范围内提高缺乏蛋白的表达。本文所述的方法为靶向和检测 sineup 诱导的所需 mrna 翻译增强提供了有益的指导, 并为转录后基因调控提供了新的工具。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了日本医学研究和发展署 (amed) 第17am0301014 号《创新生物医学基础科学和平台技术计划》、mext 向 riken 生命中心提供的研究补助金的部分支持。从 mext 到 riken ims 的科学技术和研究资助。我们感谢 pc 实验室和 sineup 网络 (sissa、东皮埃蒙特大学和 riken) 的成员进行了发人深省的讨论。我们感谢马修·瓦伦丁博士的校对。
Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |