セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

1. ターゲット Mrna の構成 SINEUP の BDs のデザイン 転写開始サイト (TSS) とターゲット興味のセルの Mrna の翻訳開始サイトをチェックしてください。エンコードとファントムの両方のプロジェクト (遺伝子発現、ケージのキャップ分析) から TSS データ集録 (ぜんぶ: http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/)。 ブラウザーを開き、興味のある遺伝子の検索やケージのピークで TSS をチェックします。 セルおよびティッシュ特定 TSS のパーキンソン病タンパク質 7 (PARK7) の分析の例を参照してください図 2に示す mRNA。 デザイン 40 に対応するいくつかの異なる長さの BD シーケンス拠点最初のメチオニン (8 月)、72 の下流の上流と 32 拠点合計で nt。 カスタム注文設計の BDs SINEUP 発現ベクター (材料の表を参照してください)。注:オフターゲット効果26を避けるために基本的なローカル配列検索ツール (ブラスト) によって配列特異性をチェックします。 2. 細胞培養とトランスフェクション SINEUP シード 6 ウェル プレートや SINEUPs の前に 24 時間 24 ウェル プレートに興味のセルです。人間の萌芽期の腎臓の細胞株 (HEK293T/17) の場合 (材料の表を参照)、種子 0.5 x 106セルよく、ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートのウェルあたり 6 ウェル プレートまたは 1.5 x 10 の5セルのあたり (材料の表を参照してください)。それは 24 h 後 70% 合流になります。 24 h 後媒体を 1.5 mL 6 ウェル プレートの新鮮な媒体または 24 ウェル プレートに新鮮な媒体の 0.4 mL に変更します。SINEUP GFP の場合 transfect pEGFP C2 の 0.6 μ g (材料の表を参照してください)、3.4 μ g pEGFP C2 の 6 ウェル プレートまたは 130 ng と 670 の 1 つの井戸の SINEUP GFP のトランスフェクション試薬 (6 ウェル プレートと 3 μ で 10 μ L と 24 ウェル プレートの 1 つの井戸の SINEUP GFP の ng24 ウェル プレート L) 製造元の指示に従って (材料の表を参照)、し、37 ° c 24 時間 5 %co2 インキュベーターで孵化させなさい。 リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) (37 mM の NaCl、8 mM Na2HPO4、2.6 mM 1.5 mM の KCl KH2PO4) 6 ウェル プレートの各ウェルに 2 mL または 0.5 mL の PBS 24 ウェル プレートの各ウェルに、細胞を洗浄します。ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートは体積トリプシンあたり 0.05% の重量の 25 μ L 5 分 5% CO2インキュベーターで孵化し、275 μ L/ウェル細胞用培地を追加します。6 ウェル プレートの場合に、各ウェルに 2 mL の PBS を追加します。収穫 (6 ウェル プレート用 1.5 mL) または 24 ウェル プレートの 225 μ L 細胞蛋白質の抽出 (蛋白質の抽出のためのプロトコル 3 に行く)、1 の 3/4、1/4 のセル (6 ウェル プレート用 0.5 mL) または 24 ウェル プレート用 75 μ L の上下にピペットで移しなさいRNA の抽出および 6,000 x g で 4 ° C (RNA の抽出のステップ 5 に進む) で 5 分間遠心します。注:イメージングによって、ポリ-D-リジン コーティング 24 ウェル プレートの SINEUP GFP の影響を分析します。手順 7 (画像解析) に進みます。 3. 蛋白質の抽出 慎重に 1.5 mL の PBS を吸引、溶解液 (20 mM トリス-HCl (pH 7.5) 150 mM の NaCl、ナ2EDTA、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1% (w/v) トリトン、ピロりん酸ナトリウム 2.5 mM、1 mM β-グリセロリン酸、1 mM Na3VO4 1 mM の 140 μ L を追加、1 μ g/mL leupeptin と 0.005% (w/v) 特異フッ化物 (PMSF)) (材料表参照) 細胞ペレットに 24 ウェル プレートの 6 ウェル プレートまたは 60 μ L の。 ピペッティングして混合し、4 ° C で 1 時間遅い速度で回転させることにより徹底的にミックス4 ° C で 10 分間 14,000 × gで遠心して上清を収集します。 比色定量法による蛋白質の集中を確認 (材料の表を参照してください)。室温でのすべての反応を準備します。 準備純水標準ウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質の 5-6 倍希釈濃度 0.2 1.5 に至る mg/mL タンパク質。毎回新鮮な基準を準備します。 試薬 S の 20 μ L (界面活性剤) で試薬 (アルカリ銅酒石酸溶液) の 1 mL を混合することによって作業試薬 Aʹ を準備します。 水 (マイナス コントロール)、BSA の標準 (タンパク質標準および肯定的な制御) または 96 ウェル プレートの各ウェルに蛋白質のサンプルの 5 μ L をロードします。 各ウェルに試薬 Aʹ の 25 μ L を追加します。慎重によく任意の気泡を避けるあたり試薬 (Folin 試薬) B の 200 μ L を追加します。アルミ箔と板をカバーし、5-10 分待ちます。 750 でタンパク質の吸光度を測定分光光度計の nm。吸光度は、少なくとも 1 時間のため安定しています。 X 軸と y 軸にそれぞれの吸光度をプロットの BSA 標準タンパク質濃度 (mg/mL) 標準曲線を準備します。標準曲線の方程式を適用することによってサンプルの蛋白質の集中を計算します。注:必要な場合は、この手順でプロトコルを一時停止または手順 4 に進みます。長期保存のためスナップは液体窒素、-80 ° C の店で蛋白質のサンプルを凍結します。 4. SDS のページおよび抗体 (ウエスタン ・ ブロット分析) とターゲット蛋白質の検出で蛋白質の分離 ローディングの染料 × 2 の 1 つのボリュームを追加 (0.1 M は 4 %sds、20% グリセロール、1.42 %2-mercaptethanol、0.2% ブロモフェノール ブルー (pH 6.8) をトリス-HCl) ステップ 3.3 からの蛋白質のサンプルの各ボリュームに。5 分間 90 ° C で加熱し、1 分間氷の上すぐにクールします。 10 %sds ポリアクリルアミドゲルに蛋白質のサンプルの 10-20 μ g を読み込み、別の 100-150 v) (材料の表を参照してください)。 0.45 μ m ニトロセルロース膜にゲルからタンパク質を転送 (材料表参照) 30 分の転送バッファー (25 mM トリス、グリシン 192 mM と 20% メタノール) 25 V とセミドライの転送装置によって。 ブロッキング液を追加 (1 x TBST バッファーで 5% 脱脂乾燥したミルク (137 mM の NaCl、20 mM トリス-HCl (pH 7.6) 0.1% Tween 20)) 膜までコンテナーが完全に浸漬、30 分間室温でインキュベート (材料の表を参照してください)。 SINEUP GFP の場合抗 GFP 抗体 (ソリューションをブロックで希釈配分) をもつタンパク質を交配させなさい (材料の表を参照してください) 室温で揺れと 30 分のため膜の孵化によって。内部制御タンパク質として抗 β-アクチン抗体 (ソリューションをブロックで希釈配分) を交配させることによって β-アクチン タンパク質を検出 (材料表参照) 室温で揺れと 30 分のため。 膜が完全に浸漬との洗い 5 分間室温になるまで、1 x TBST バッファーをコンテナーに追加します。(3 つの洗浄の合計) 複数回洗浄手順 2 を繰り返します。 希釈 (ソリューションをブロックで 1: 1000) に GFP タンパク質を交配させる抗家兎抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の共役し、する β-アクチン タンパク質を交配させる希釈膜に HRP に共役 (ソリューションをブロックで 1: 1000) 抗マウス抗体部屋の温度で振とうしながら 30 分。 室温で 5 分の 1 の x TBST のバッファーを持つ膜を洗浄します。(3 つの洗浄の合計) 複数回洗浄手順 2 を繰り返します。 HRP が強化された化学発光 (ECL) 検出試薬 1 と 2 (材料の表を参照してください) の等量をミックスします。2 mL ECL 試薬ミックスに膜を転送、アルミ箔でボックスを蓋をして室温で 1-2 分間インキュベートせてください。慎重に ECL 試薬ミックスから膜を削除し、発光の計測器をイメージングを使用して公開します。 5. RNA の抽出と DNase 処理 抽出総 RNA 次標準的な単分子膜27で育った細胞からの RNA 抽出のためのプロトコルか代わりに市販の RNA 抽出キット (材料の表を参照してください)。状態に簡単に言うと、イソチオ シアン酸グアニジンの任意の単相性溶解試薬 (MLR) を追加し、フェノールで収穫された細胞にステップ 2.3 (500 万セルあたり 1 mL MLR)27。注:手袋を頻繁に変更します。RNase フリー試薬とジエチルピロカーボネート (DEPC) を使用して-プラスティック用品や RNA の劣化を防ぐためにガラス製品を扱います。必要な場合は、この手順でプロトコルを一時停止します。ストアは-80 ° C で RNA を抽出 ステップ (材料表参照) 5.1 から浄化された RNA に DNase バッファー x 10 と DNase の 2 U の 0.1 のボリュームを追加します。 ヌクレアーゼ フリー水 50 μ L 反応ボリュームを設定、軽く混ぜます。37 ° c 30 分間インキュベートします。 再懸濁の DNase 不活化試薬の 0.1 のボリュームを追加し、よく混ぜる (材料の表を参照してください)。穏やかな揺れで室温で 5 分間インキュベートします。 90 s. 転送の 10,000 × gで遠心分離機、新鮮な RNase フリー 1.5 mL チューブに上清 (無料の DNA RNA)。これは後工程のために面倒である DNase のキャリー オーバーを引き起こすので、ペレットに触れないように注意してください。 260 、260/A280の比率を測定することにより RNA 量的に表わす (純粋な RNA 範囲は 1.8 2.0) 紫外線分光光度計で。 6. 最初繊維の cDNA 合成と qRT PCR 解析 CDNA の統合 (材料の表を参照) 以下として標準的な cDNA の統合のプロトコル、次を実行します。 全反応量 10 μ L で 200-500 ng のトータル RNA (手順 5-8) からの 0.75 μ M オリゴ dT プライマー、4.3 μ M 任意プライマー、dNTPs (10 mM) をミックスします。65 ° C で 5 分間加温、氷の上をすぐに置きます。 1 x 逆転写酵素バッファー、1 U の RNase 阻害、逆転写酵素の 10 U をミックスし、10 μ L RNA プライマー ミックス 6.1.1 から追加します。 必要な場合は、全反応ボリュームをヌクレアーゼ フリー水 20 μ L に設定します。穏やかに混合および 30 ° c、10 分、60 分、42 ° C で反応混合物を孵化させなさいそして酵素を不活化する 5 分の 95 ° c。氷の上の管を冷却します。注:RNA のサンプルおよび氷の上のすべての試薬を解凍し、氷に反応混合物を準備します。ターゲット Rna はポリア Rna のみである場合は、oligo dT プライマーのみ (2.5 μ M) を使用します。必要な場合は、プロトコルを一時停止します。-20 ° C で合成した cDNA を格納します。 技術をトリプリケートで qRT PCR を実行 (n = 3、Cт 標準偏差 > 0.2) と生物学的複製 (n ≥ 3) 内 10 ng cDNA の 1 μ L、逆プライマー (10 μ M)、前方のプライマー (10 μ M)、DNA ポリメラーゼの混合液の 10 μ L の 0.4 μ L の 0.4 μ L を使用して、二重鎖 DNA 染色色素、ヌクレアーゼ フリー水の 10 μ L の 0.4 μ L (反応量は 20 μ L) 以下の条件を使用して PCR の製品を検出するには30 段階 (1 サイクル) を保持する 95 ° C、5 段階 (40 サイクル) をサイクリングで s s 95 ° c、30 の 60 ° c、s 曲線のステージを溶かします。人間の Gapdh_Fw のプライマーの例を示します: TCTCTGCTCCTCCTGTTC、人間 Gapdh_Rv: GCCCAATACGACCAAATCC、EGFP_Fw: GCCCGACAACCACTACCTGAG、EGFP_Rv: CGGCGGTCACGAACTCCAG、SINEUP GFP_Fw: CTGGTGTGTATTATCTCTTATG と SINEUP GFP_Rv: CTCCCGAGTCTCTGTAGC。材料の表を参照してください。2- ∆∆Ct ± SD 法28RNA 発現を定量化を分析します。 7. イメージングによる半自動化された検出法による SINEUPs の解析 0.5 ml の PBS の 24 ウェル プレートのウェル 1 個の細胞を洗浄します。 2.0 μ g のヘキスト 33342 (材料の表を参照) を追加 (500 μ L の PBS で溶解) 各 24 ウェル プレートの細胞核を染色する 20 分の 37 ° C で孵化させなさい。 メジャー ヘキスト染色 461 nm の青色発光の最大値と緑色発光最大 510 の GFP 陽性細胞の数をカウントする緑の蛍光性の強度のセルの合計数をカウントするセルによるハイスループット マイクロもイメージの cytometer (nm材料のテーブルを見なさい)。29イメージング ソフトウェアを使用して、各チャネルの計算分割オブジェクトに信号を表示するすべてのピクセル強度の合計をである GFP 統合の強さを計算することによって、SINEUPs の蛋白質を規制効果を分析します。 (手順 5 と 6) に RNA の発現を確認する細胞を収穫します。