Her beskriver vi en protokol for at måle glomerulær filtrationshastighed (GFR) i bevidst, frit flytte mus benytter en transdermal GFR dataskærm.
Transdermal analyse af glomerulær filtrationshastighed (GFR) er en etableret teknik, som bruges til at vurdere nyrefunktionen i mus og rotter modeller af akutte nyre skade og kronisk nyresygdom. Målesystemet består af en minituariseret fluorescens-detektor, der er direkte knyttet til huden på bagsiden af bevidst, frit bevægelige dyr, og måler udskillelse kinetik af eksogene GFR tracer, fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugeret sinistrin (en inulinsirup analog). Dette system er blevet beskrevet i detaljer i rotter. Men på grund af deres mindre størrelse, måling af transkutan GFR i mus præsenterer yderligere tekniske udfordringer. I dette papir giver vi derfor den første detaljerede praktiske vejledning til brug af transdermalt GFR skærme i mus baseret på den kombinerede erfaring af tre forskellige efterforskere som har udøvet denne analyse i mus over en årrække.
Brugen af transkutan GFR skærme i mus blev først rapporteret af Schreiber og kolleger i 2012 og blev valideret ved at sammenligne GFR målinger fremstillet ved hjælp af denne teknik, med resultater opnået ved direkte måling af FITC-sinistrin bolus clearance fra seriel blodprøver1. Til dato har der været 35 peer-reviewede publikationer som transkutan GFR skærme er blevet anvendt i rotter og mus (en regelmæssigt opdateret liste over tidsskriftartikler og konference abstracts prækliniske GFR skærmen blev brugt kan findes på den MediBeacon hjemmeside2). Transdermal GFR målinger i rotter og mus er blevet beskrevet i en række publikationer1,3,4,5, og en video tutorial demonstrere sin anvendelse i rotter har været udgivet6. Dog præsenterer måling i mus yderligere tekniske udfordringer. Her, giver vi den første detaljerede praktiske vejledning til brug af transdermalt GFR skærme i mus.
Der er en række årsager hvorfor efterforskere er begyndt at favorisere brug af transdermalt GFR skærme nyrefunktionen i gnavere modeller. Transdermal måling af FITC-sinistrin clearance har vist sig at give en mere følsom og præcis måling af nyrefunktion sammenlignet med de traditionelle parametre af nyrefunktionen som serum kreatinin og blod urea nitrogen (bolle)7, 8. Ved at gennemføre en bedre evaluering algoritme, viste Friedemann og kolleger at systemet når præcision sammenlignes med guld standard, den konstante infusion teknik for GFR måling3. Nylige undersøgelser har også vist at sekventielle analyse ved hjælp af transkutan GFR skærme kan bruges til at studere tidlige ændringer i nyrefunktionen samt funktionel genopretning efter induktion af akutte nyre skade (AKI) uden at forstyrre dyrenes blod volumen eller Hæmodynamik, blod da analysen ikke kræver sekventiel prøveudtagning9,10. Evnen til at måle GFR med høj præcision og følsomhed gentagne gange i den samme dyr gør denne teknik attraktiv for en lang række forskellige forskningsdiscipliner. Transdermal GFR skærme har været brugt af farmaceutiske virksomheder til at vurdere toksicitet af nye forbindelser, samt på universiteter for grundlæggende og Translationel forskning.
Dette manuskript og den medfølgende Træningsvideo give praktiske retningslinjer for brug af transdermalt GFR skærme i mus. De mest kritiske trin i proceduren, der er den korrekte fastgørelse af enheden på dyrets ryg, og sikkert indpakning tape omkring maven. Den bedste stilling er enten lidt venstre eller højre for midterlinjen, over brystkassen. Den lappe og enhed skal være solidt fastgjort til huden, men de bør ikke være så stramme at de begrænser vejrtrækning, bevægelse, eller påvirker huden blod omløb under enheden, da dette ville føre til fejlagtige/unøjagtige målinger. Desuden, da overvågning opstår i bevidst mus, efter de har inddrevet fra anæstesi, korrekt placering af enheden fra kroppen med laveste interferens fra bevægelse resultater i transdermal målinger med lidt bevægelse artefakter. Derfor er det vigtigt, at enheden ikke er placeret for tæt på øvre lemmer for at musene kan flytte deres skuldre frit.
Det er vigtigt at depilate mus en til to dage før måling af GFR, som hårfjerning påvirker målingen af FITC-sinistrin clearance, med foreløbige data, der viser at afhåring umiddelbart før måling af transdermalt GFR øger den tilsyneladende half-life af FITC-sinistrin. Mekanismen til dette er ukendt. Derfor, for at opnå pålidelige målinger over flere tidspunkter og mellem eksperimenter, det er tilrådeligt at depilate mus på forhånd, for at tillade huden at inddrive fra denne proces, før du fortsætter med GFR målinger. Hårfjerning fløde bør ikke anvendes til det samme område af huden inden for 72 timer af en forudgående program, for at undgå kemiske skader på huden. I mange tilfælde pels re-vækst tager flere dage eller op til en uge, og så fornyet påføring af hårfjerning fløde inden for 72 timer kan nemt undgås.
Fordi op til 50% af serum kreatinin er udskilt af rørformede afsnit i mus13, og fordi der er øget reabsorption af urinstof fra renal tubuli, når musene er dehydreret14, er serum kreatinin og BUN dårlig markører af nyrefunktionen. Dog på grund af deres bekvemmelighed fortsat disse assays anvendes som det vigtigste mål for nyrefunktionen i prækliniske studier af AKI og CKD i mus. Overensstemmelse med store bidrag af tubulær sekretion at kreatinin udskillelse i mus med normal eller nær normal nyrefunktion13, serum kreatinin viste imidlertid lidt korrelation med FITC-sinistrin clearance til stor frihøjde priser (lav FITC-sinistrin half-life), der angiver, at kreatinin er en ufølsom foranstaltning af nyrefunktionen i mus med mild nyre skade. I modsætning, mens BUN korrelerer med FITC-sinistrin clearance i mus med mild nedsat nyrefunktion, er der dårlig sammenhæng mellem bolle og FITC-sinistrin clearance i mus med mere alvorlige nyre skade (høj FITC-sinistrin halveringstid). Dette er sandsynligvis forårsaget af virkningerne af urinstof reabsorption forbundet med dehydrering hos syge dyr med svær nyre skade.
En stor fordel ved transdermal GFR måling, i forhold til alle andre bolus clearance eller konstant infusion teknikker til måling af GFR, er, at det ikke kræver omhyggeligt timet blod eller urin samlinger. Disse kan være særligt udfordrende i mus, som de har lavt total blodets diskenheder og urin output sammenlignet med rotter. Mus skal desuden behandles kun for fastgørelse af enhed og injektion, men ikke for flere venipunctures, som kræves til klassisk bolus clearance eksperimenter15. Endvidere varigheden af anæstesi er kort, og som sådan er det muligt at udføre gentagne målinger i individuelle mus over tid. Den hyppighed hvormed målinger kan foretages primært afhænger af på sundhedstilstanden hos mus, forskerens aptitude for intravenøse injektioner, og lokale institutionelle bestemmelser gentagne anæstesi sessioner. I sund, uskadt mus, kan transdermal GFR målingen foretages dagligt, med minimal eller ingen negative virkninger på musen. Men sårede mus lider af AKI eller Cementovnstøv er usandsynligt, at tolerere gentagne anæstesi sessioner samt sund mus, og dermed hyppigheden af maalingerne bør reduceres.
Den største begrænsning af transdermalt GFR måling, sammenlignet med bolus clearance metoder til måling af GFR i mus er, at udskillelse kinetik er kun målt som ændringer i relative fluorescens intensitet over tid, og ikke som absolutte tracer koncentrationer. På grund af dette er det kun muligt at måle konstanten enkelt eksponentiel henfald af udskillelsen kinetic, som er en meget tæt estimat af GFR normaliseret ekstracellulære volumen16. For at udtrykke GFR i mL/min, har den ekstracellulære volumen af dyret til estimeres ved hjælp af en omregningsfaktor, der blev etableret i forudgående undersøgelser, hvor samtidige målinger af plasmakoncentrationer af FITC-sinistrin blev udført1. Dog denne omregningsfaktor kan ikke rigtigt vurdere ekstracellulære væske diskenheder lige så godt i alle mus, da væske volumen kan blive påvirket af en række eksterne faktorer, herunder alder, køn, hydrering status (som kan være påvirket af kirurgisk interventioner samt nyre skade), og vægt17. Men i modsætning til bolus dosering metode til at vurdere GFR i mus, transkutan GFR måling er underlagt mindre afhænger af operatøren variation som den ikke påvirkes af dosering fejl eller fejl i timing af blod samlinger.
En anden begrænsning af transkutan metode til måling af GFR er, at baseline signal forskydninger kan forekomme i løbet af måling på grund af blegning af huden fluorophores og anesthesia krævede for enhed vedhæftede fil og tracer injektion. Denne begrænsning blev behandlet af Friedemann og kolleger ved at gennemføre en korrektion algoritme3. Gennemførelsen af denne algoritme ført til en forbedring i præcision af transdermalt teknik sammenlignes med en konstant infusion teknik til vurdering af GFR.
Ofte stillede spørgsmål er, om hudpigmentering i forskellige mus stammer påvirker transdermal FITC-sinistrin clearance. Hudpigmentering reducerer FITC-sinistrin signal intensitet da mørke pigmenter absorberer de blå excitations- og den grønne signaler fra FITC-sinistrin målinger. Men den udskillelse sats af FITC-sinistrin er uafhængig af samlet signal intensitet. Endvidere, mens det målte signal er lavere, baggrund signal er også lavere i pigmenteret mus. Fordi baggrunden signal er en blanding af autofluorescence af huden fluorophores og refleksion af excitation-lyset, har vi fundet, at baggrunden til maksimalt signal forholdet er sammenlignelige, eller endnu bedre, i pigmenteret dyr. Derudover bevægelse artefakter, som er forårsaget af eksponering af den omkringliggende hud til reflekteret lys, er reduceret i pigmenteret mus da det reflekterede lys er også optaget af pigmenteret hud.
Afslutningsvis den teknik vi har præsenteret giver mulighed for præcis måling af GFR i bevidst, frit flytte mus af alle hudtyper. Teknikken er uafhængig af udtagning af blodprøve, kan det bruges flere gange på de samme dyr for langsgående observationer i Cementovnstøv modeller, samt til måling af hurtige ændringer af GFR, der opstår efter induktion af AKI.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Vanderbilt Center for nyre sygdom (VCKD), og var delvist finansieret af de følgende tilskud: DOD PR161028 og R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Vi anerkender støtte til LS, PM og BW af MRC, EPSRC og BBSRC-finansierede UK regenerativ medicin Platform “Sikkerhed og effektivitet, fokuserer på Imaging-teknologier Hub” (hr./K026739/1).
Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger) | MediBeacon GmbH | TDM-MH001 | Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio |
Additional Batteries | MediBeacon GmBH | PWR-BT0001 | |
Attachment patches | MediBeacon GmbH | small: PTC-SM001; large: PTC-LG001 | |
FITC-sinistrin | MediBeacon GmbH | FTC-FS001 | |
Hypoallergenic silk tape | e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00) | ||
Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen | |||
Heat pad | |||
Electric shaver | |||
Depilatory (hair removal) cream | e.g. Veet or Nair | ||
Cotton buds | |||
Cotton swabs | |||
Timer | |||
Scales | |||
70% ethanol wipes |