Summary

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Published: December 14, 2018
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Summary

Qui vi presentiamo il nostro protocollo per produzione indotta da progenitori eritroidi (iEPs) dai fibroblasti adulti del mouse utilizzando la trascrizione factor-driven diretto lignaggio riprogrammazione (DLR).

Abstract

Differenziazione e impegno delle cellule eritroidi procedere attraverso l’attivazione di una rete di transcriptional lignaggio-limitata orchestrata da un gruppo di destino delle cellule determinazione e fattori di maturazione. Abbiamo precisato in precedenza per definire il set minimo dei fattori necessari per istruire il globulo rosso sviluppo utilizzando discendenza diretta riprogrammazione dei fibroblasti in progenitori/precursori eritroidi indotta (iEPs). Abbiamo mostrato che la sovraespressione di Gata1, Tal1, Lmo2e c-Myc (GTLM) può rapidamente convertire murine ed umane fibroblasti direttamente a iEPs che assomigliano alle cellule eritroidi bona fide in termini di morfologia, fenotipo, e l’espressione genica. Intendiamo che iEPs fornirà uno strumento prezioso per studiare il regolamento di destino delle cellule e di eritropoiesi. Qui descriviamo il processo graduale di conversione fibroblasti punta coda murino in iEPs tramite trascrizione factor-driven discendenza diretta riprogrammazione (DLR). In questo esempio, eseguiamo la riprogrammazione in fibroblasti dai topi di lignaggio traccia degli eritrociti che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) sotto il controllo del promotore del gene (EpoR) del recettore dell’eritropoietina, consentendo la visualizzazione di cellule eritroidi induzione di destino su riprogrammazione. A seguito di questo protocollo, fibroblasti possono essere riprogrammati in iEPs entro cinque-otto giorni.

Mentre possono ancora essere apportati miglioramenti al processo, indichiamo che GTLM-mediata riprogrammazione è un processo rapido e diretto, producendo cellule con proprietà di bona fide cellule eritroidi progenitrici e precursore.

Introduction

Globuli rossi (RBCs) sono essenziali in tutti i vertebrati e costituiscono l’84% di tutte le cellule dei corpi umani1. Da embrionali alla vita adulta, la nostra salute dipende altamente esatta regolazione dell’omeostasi di RBC. La produzione costante di RBCs maturo nel corso dello sviluppo in età adulta è noto come eritropoiesi. Una sfida importante nella ricerca di eritropoiesi è quello di definire i regolatori matrici che orchestrano sviluppo di RBC e lo switch tra eritropoiesi primitivo e definitiva. Discendenza diretta riprogrammazione dei progenitori eritroidi rappresenta un’opportunità per capire meglio degli eritrociti sviluppo in vivo.

Discendenza diretta riprogrammazione (DLR), noto anche come transdifferenziazione, è il processo di riprogrammazione di un tipo delle cellule direttamente in un altro, bypassando pluripotenti e fasi di progenitrici multipotenti. DLR finora è stato utilizzato per la produzione di numerosi tipi cellulari inclusi neurali2, ematopoietico3,4,5, epatica6 e nefrotica7, cellule progenitrici. Per i biologi dello sviluppo, DLR è diventato uno strumento importante per inquisitorie aspetti dell’impegno di lignaggio e differenziazione terminale processi8,9. DLR possono integrare e sostituire parzialmente in vivo studi per comprendere i meccanismi del destino delle cellule durante lo sviluppo i fattori determinanti. Il protocollo DLR per la riprogrammazione di progenitori eritroidi descritti in questo documento fornisce il campo un metodo gratuito per studi evolutivi dell’eritropoiesi.

Precedentemente abbiamo dimostrato che la sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per riprogrammare i fibroblasti sia murini ed umani direttamente ai progenitori eritroidi indotta (iEPs) 10. cellule eritroidi riprogrammato il GTLM assomigliano notevolmente bona fide degli eritrociti primitivi progenitori in termini di morfologia, fenotipo e gene espressione10. Così iEPs hanno una limitata capacità di proliferazione e matura in eritrociti nucleati simili a quelle prodotte transitoriamente nell’embrione precoce prima dell’inizio della eritropoiesi definitivo. Apportando modifiche nelle condizioni riprogrammazione (per esempio, mutazioni puntiformi nella riprogrammazione fattori o aggiunta di altri fattori), si può capire come questo comporti cambiamenti nello sviluppo degli eritrociti e differenziamento. Ad esempio abbiamo indicato che aggiunta di Klf1 o Myb al cocktail GTLM cambia il modello di espressione della globina da prevalentemente embrionale (primitivo) per principalmente per adulti (definitivo). Questa individuazione conferma la validità dell’utilizzo di DLR come strumento per la definizione dei fattori dello sviluppo nella eritropoiesi.

Qui, descriviamo il processo di generazione iEPs da fibroblasti di topo coda punta (TTF). Nei nostri risultati rappresentativi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor– Cre R26– eYFP) che esprimono la proteina fluorescente gialla (eYFP) dal locus Rosa26 in tutte le cellule che hanno espresso il recettore dell’eritropoietina, permettendo facile visualizzazione di impegno per la stirpe degli eritrociti. Utilizzando questo metodo, YFP positivo (EpoR +) cellule sono presenti già cinque giorni dopo la trasduzione. Questo protocollo, pertanto, offre una tecnica veloce e affidabile per la generazione di progenitori eritroidi in vitro.

Protocol

1. stabilimento ed il mantenimento della coda del Mouse primario suggerimento culture del fibroblasto Preparare piatti rivestite con gelatina (consigliamo un piatto di 10 cm per una coda) che copre la superficie con 0,1% di gelatina e incubando i piatti per circa 20 min a 37 ° C. Aspirare la soluzione di gelatina dal piatto e lasciare asciugare per almeno 2 h. Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Rimuovere la coda con le forbici, tagliare alla base della coda. Mettere la coda in soluzione tamp…

Representative Results

Qui presentiamo un protocollo riproducibile per la produzione di iEPs dai fibroblasti adulti utilizzando trascrizione factor-driven DLR. Valutiamo la riprogrammazione delle cellule tramite flusso cytometry, formanti colonie saggi e gene analisi di espressione. Al fine di facilitare la visualizzazione della conversione al destino delle cellule eritroidi, abbiamo effettuato la riprogrammazione sui fibroblasti dai topi lignaggio traccia degli eritrociti (Epor- Cre R26- eYFP…

Discussion

Sovraespressione di un cocktail di quattro-fattore, GATA1, TAL1, LMO2 e c-MYC (GTLM), è sufficiente per la riprogrammazione di fibroblasti murini ed umani direttamente a iEPs10. Cellule eritroidi riprogrammate notevolmente ha assomigliato a bona fide progenitori eritroidi in termini di morfologia, fenotipo, espressione genica e possibilità di formazione di colonie. Questa scoperta co…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Evelyn Wang e Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) per la clonazione e Harvey Lodish (Whitehead Institute) per fornire molti dei plasmidi utilizzati per generare la libreria retrovirale. Ringraziamo Riccardo Siva e Sofie Singbrant (dipartimento di medicina molecolare e Gene Therapy, Università di Lund), Göran Karlsson e Shamit Soneji (dipartimento di ematologia molecolare, Università di Lund) per i loro ruoli nella descrizione della produzione iEP. Inoltre vorremmo citare e ringraziare Julian Pulecio (centro di medicina rigenerativa, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Istituto di ricerca medica di St. Vincent e Dipartimento di medicina, ospedale di St Vincent, Università di Melbourne), Ángel Raya (Istituto Catalano per la ricerca e studi avanzati, Barcellona) e Vijay G. Sankaran (Broad Institute del Massachusetts Institute of Technology e Harvard, Cambridge ) per i loro contributi precedenti a questo lavoro. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione Söderberg Ragnar (di J.F.); la svedese di ricerca Consiglio (di J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (di J.F.); la Fondazione svedese per la ricerca strategica (a J.F.); Fondazione di Åke Wiberg (di J.F.); una borsa Marie Curie di integrazione (di J.F.).

Materials

DMEM without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01 Culturing media for PhGP cells
DMEM with sodium pyruvate GE Life Sciences SH30243.01 Culturing media for tail tip fibroblasts
StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) Stem Cell Technologies 9650 Reprogramming media 
Fetal Bovine Serum HyClone GE Life Sciences SH30071.03HI Growth factor
Penicillin/Streptomycin HyClone (100x) Ge Life Sciences SV30010 Antiboiotic
Non-Essential Amino Acids (100x) Thermo Fisher 11140050 SNL media is suppplemented with this
Trypsin HyClone (1x) GE Life Sciences SH30042.01 Cell dissociation agent
Murine Stem Cell Factor (mSCF) Peprotech 250-03 Added to reprogramming media
Recombinant Murine Il-3 Peprotech 213-13 Added to reprogramming media
human recombinant erythropoietin (hrEPO) Peprotech 100-64 Added to reprogramming media
Dexamethasone Sigma 50-02-2   Added to reprogramming media
Gelatin from porcine skin Sigma 9000-70-8  Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.
Blasticidin S hydrochloride Sigma 3/9/3513 Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Ge Life Sciences SH30850.03 Used for washing steps
Polybrene Merck TR-1003-G Infection / Transfection  Reagent
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection Reagent for PhGP cell line
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Merck SLGP033RS Used for filtering virus supernatant
BD Emerald Hypodermic Syringe Becton Dickinson SKU: 307736 Used for filtering virus supernatant
100 mm Culture Dish Corning 430167 Cell culture
6-well plate Falcon 10799541 Cell culture
Jeweler Forceps #5 Sklar 66-7642 Used for handling small tail fragments
Sklarlite Iris Scissors Sklar 23-1149 Used for cutting the tail into small pieces
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec 130-090-858 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
CD117 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotec 130-091-224 For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures
PheonixGP cells ATCC CRL-3215 retroviral packaging cell line
EcoPAC vector (pCL-Eco)  Novus Biologicals NBP2-29540 retroviral helper vector containing gag and pol genes
pMX-Gata1 Cloned in-lab
pMX-Tal1 Cloned in-lab
pMX-Lmo2 Cloned in-lab
pMX-cMyc Cloned in-lab
CellSens Standard 1.6 software  Cytospin analysis software

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Ilsley, M., Capellera-Garcia, S., Dhulipala, K., Johansson, A., Flygare, J. Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors. J. Vis. Exp. (142), e58464, doi:10.3791/58464 (2018).

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