여기, 우리는 생물 학적 및 생물 의학 연구에 모델 인간의 폐 질병에 3D 폐 조직 문화를 생성 하는 데 적합 한 절제 환자 조직에서 인간의 정밀 컷 폐 agarose 가득 조각의 준비에 대 한 프로토콜 제시.
인간의 질병에 새로운 발견의 번역은 질병의 인간 조직 기반 모델의 가용성에 의해 제한 됩니다. 정밀 컷 폐 (웹) 사용 하는 3D 폐 조직 문화 (3D-Ltc) 대표는 우아한 조각과 관련성이 높은 생물학 3D 셀 문화 모델, 매우 닮는 그들의 복잡성, 역학 때문에 원래의 조직 및 분자 구성입니다. 조직을 자르는 널리 다양 한 동물 모델에 적용 됩니다. 3D-Ltc 인간의 웹에서 파생 된 더 메커니즘 및 인간의 조직에 약물의 기능 효과 더 잘 이해 하는 데 도움이 수도 있습니다 새로운 약물에 대 한 응답을 분석을 사용할 수 있습니다. 환자의 폐 lobectomy 경험, 수술 절제 폐 조직 샘플에서 웹의 준비 증가 질병의 접근 및 peritumoral 조직. 여기, 우리 인간의 웹 수술 절제 소프트 탄성 환자 폐 조직에서의 세대에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 따라서 폐 구조를 유지 하 고 후속 부 러 뜨 리는 중요 한 조직의 강성 증가 Agarose는 resectates의 bronchoalveolar 공간에 도입 되었다. 500 µ m 두께 슬라이스는 vibratome와 함께 조직 블록에서 준비 되었다. 웹에서 찍은 생 검 펀치 유사한 조직 샘플 크기 고 더 조직 샘플의 양을 증가. 생성 된 폐 조직 문화는 다양 한 이상과 그것의 최고의에서 (sub-) 세포 수준에서 거리 프로세스와 같은 다른 질병의 기계 장치를 포함 하 여 인간의 폐 생물학에서 연구에에서 적용할 수 있습니다. 3D-LTC 비보 전 모델의 최고 장점은 3D 조직 아키텍처, 셀 유형 다양성 및 폐 해부학 뿐만 아니라 개별 환자에서 조직 평가 대 한 가능성에 대 한 원래의 인간 폐의 그것의 가까운 표현입니다는 정밀 의학에 대 한 새로운 전략 개발 관련이 있다.
만성 및 급성 폐 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계1의 주요 원인이 다. 폐쇄성 폐 질환 (COPD)2, 심한 천식3, 폐 암4 확산 parenchymal 폐 질환5같은 만성 폐 질환 환자, 치료 요법 현재 사용할 수 있습니다. 폐 질환 동물 모델에서 연구 질병 pathomechanisms6 의 이해를 심화 하 고 잠재적인 새로운 치료 목표7,8,의9의 id에 지도 이 모델 관련 생물학과 생리 적인 차이 인간10에 비해 전시. Murine 인간과 생물학 뿐만 아니라 해부학, ex vivo 3D 폐 조직 문화 인간 사이의 이러한 차이 극복 하기 위해 (3 차원-LTC) 시스템 생물 의학 연구의 다양 한 분야에서 사용 됩니다. 이러한 3D LTC 문화 시스템 정밀 컷 폐 조각 (웹)을 기반으로 합니다. Ex vivo 웹의 세대 수 세 번째 공간 차원, 전체 폐 포 및 항공11, 뿐 아니라 interstitium, 맥 관 구조에 있는 셀의 공간 및 기능적 관계의 조사에 대 한 수의 분석 및 mesothelium입니다. 특히, ex vivo 모델 웹은 다세포, 그들은 현장에서 폐의 기능적인 세포 포함 의미, 따라서 밀접 하 게 대표 하는 셀의 원래 생물 환경 및 따라서 제한 된 셀 대부분 2D 상호 작용 세포-매트릭스를 극복 세포 배양에 접근 한다. 지금까지, ex vivo murine 웹 폐 질환, COPD12, 폐 섬유 증13, 폐 암14, 바이러스 성 감염15,16, bronchopulmonary 발육 이상17, 같은 모델에 사용 된 고 천식18. 그러나, 새로운 약물 요법 임상 시험에서 조사 되었다 인간 폐 질환에서의 상당한 비율 번역 하지 않습니다 효능 또는 안전의 그들의 부족으로 인해 병원에 가정 하 여로 인해 아직 인간 사이의 상당한 차이 murine 생물학 및 질병19,,2021.
몇 년 동안 인간의 웹 주로 화학 물질 및 약물의 폐 독성을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 최근, 인간의 폐 조직 병 태 생리 및 약리 연구를 추구 하 COPD22,23,24, 천식 폐 섬유 증25, 환자에서 사용 되었습니다. 으로 절제 환자 장기 소재를 사용 하 고 생성 하는 웹, 하나는 복잡 한 3 차원 조직 환경22 대표 및 장기의 원시 세포 다양성의 대부분을 유지 하는 주요 질병 특징 정리 수 있습니다. 또한, 실험 설정의 다양 한 적용 병에 걸리는 조직 간, 소장, 신장26,27,,2829질병 같은 변화를 모방 표시 했다.
그러나, 처리 폐 조직의 여러 가지 이유로 도전 남아 있습니다. 단단한 조직, 달리 네이티브 폐 실질 환기 없이 축소 하는 경향이 있다 그리고 전시 더 낮은 조직 강성. 이러한 속성은 조직의 슬라이스 방해. 따라서, 항공 및 낮은 녹는 포인트 agarose와 치조 공간 작성 네이티브 폐 구조를 유지 하 고 정밀 컷 murine 인간과 폐30의 조각화에 필요한 강성을 제공 합니다. 인간의 폐 resectates 연구 목적으로 기증 함으로써 그들의 본성 해부학, 유전자 및 생리 적으로 매우 다양 한, 따라서 종종 제시 높은 간 환자 변화 실험25를 수행할 때 있습니다. 전체 엽 또는 전체 폐 explants는 달리 흉부 수술을 통해 절제 하는 폐 샘플 반드시 해부학 세그먼트를 따라 고, 그러므로, 특별 한 준비가 필요. 이 문서에서는, 우리 모델 폐 질환 폐 절제 조직 및 후속 재배 실험 사용에서 인간의 웹의 세대에 대 한 상세 하 고 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.
이 원고에 설명 된 프로토콜 액체 agarose 및 후속 vibratome 슬라이스 작성 하 여 인간의 폐 조직 resectates에서 웹의 세대를 다루고 있습니다. 조직 조각의 세대 전에 뇌, 간 등 장기의 몇 이러한 장기의 고유 강성 조직의 수정 없이 슬라이스 직접 첨부 시연 했다. 메모의 폐 조직의 초기 적절 한 준비는 생성 하는 웹에서 가장 중요 한 단계 이다. 폐의 Agarose 작성은 부드럽고 탄력 있는 자연, 안정 하 고 균일 하 고 재현성 웹 생성 되도록 선택 방법입니다. 절제 폐 조직의 큰 항공은 그대로 폐 실질에 뿐만 아니라 작은 항공에 대 한 액세스를 제공 하기 위해 cannulated. 거의 불가능 하 게 작성 하는 agarose는 그대로 늑 막의 부족은 폐 조직 폐 부 러 뜨 리는 사용할 수 없는 대부분 이유는 주요 이유 이다. Prospectively, 원래 decellularized 건설 기계에 기능 실험을 수행 하도록 설계 된 합성 늑 그대로 늑31부족 explants의 성공적인 agarose 충전을 달성 하기 위해 적용할 수 잠재적으로. 그대로 늑 막으로 인간의 폐 조직에에서 발생 하는 절제 조직 블록 슬라이스를 생성 하기 위한 필수적입니다. 절제 조직 완전히 그대로 돌출부 또는 전체 폐 explants 폐 이식 수술 환자 보다 암 절제술에서 조직 종양 무료 인 더 제공 됩니다.
일반적으로, 두 시스템은 웹을 생산 하기 위해 사용 됩니다: Krumdieck 조직 슬라이서15 및 진동 microtomes (vibratomes). 조직 슬라이서가이 배 끝에 90 °에는 웹을 인하 하는 금속 그릇을 통해 조직 블록을 전달 하 여 분할 영역을 생성 합니다. Vibratomes는 진동 이동 하 여 웹 생성 Krumdieck 기계에 비해 냉각된 매체 욕조에 잠긴 조직 고정된 블록 위에 가로로 칼 적은 전단 힘 조직에 미치는. 재배 하기 전에 조직의 덜 가혹한 치료 결과. 다른 한편으로, vibratome 절단은 더 많은 시간을 소모 하는 작업입니다. 우리의 손에서 vibratome 100 웹 또는 500 웹 최대의 생산을 활성화 슬라이스 한 날, 가장 실험 연구에 대 한 충분 한 펀치. 웹 다양 한 방법으로 경작 될 수 있다: (a) (b)으로 동적 기관 문화 (DOC), (알리) 시스템, 트랜스-웰 스, 따라서 생성 하는 공기 액체 인터페이스에 연결 된 또는 (c) 표준 세포 배양 조건에서 세포 배양 매체에 빠져들. 웹의-세부 재배는 앞에서 설명한22,,2325; 그러나, 전 세계 다양 한 실험실에서 그들의 사용 사이 재배 조건의 일반적인 표준이 아직 없습니다. 특히, 문화 시간 중요 한 수 있습니다: murine 웹에서 SFTPC 긍정적인 치경 유형 2 셀의 손실을 관찰 후 144 h, 하지만 120 h22후. 또한, 신진 대사 활동 murine22 와 인간의 웹25 120 h에서 안정적으로 유지 것으로 보인다.
웹의 세대에 대 한 기술적 제한의 몇 가지 있다: 수와 크기는 resectates의 변동 동안; 얻은 조직 내에서 그대로 늑 막의 존재에 달려 있는, agarose의 효율성 결정 웹 세대;의 마지막 성공 그리고 획득된 (병) 폐 조직 내의 병 적인 변화에 의해 발생 하는 조직 파괴 웹 준비를 방해할 수 있습니다. 기도 장애물 및 거리 조직 그대로 치조 공간 부족 agarose 작성을 방해 고 따라서 까다로운 작업 거리 조직의 슬라이스. Emphysematous 조직으로 발견 질병에와 같은 COPD 또는 알파 1-안티 트립 신 결핍증, agarose의 압력을 저항 하지 수 건축 유물 및 폐 포의 파열 귀 착될 것 이다. 이러한 경우에, 낮은 agarose 농도, 예를 들어, 1% (w/v)의 사용 압력 감소 agarose 작성 하는 동안 속도를 유용할 수 있습니다. 전반적으로, 조직의 질병 상태 극적으로 웹 세대에 대 한 직물의 사용을 제한할 수 있습니다. 이러한 모든 매개이 변수는 폐 조직에서 생성 될 수 있는 웹의 금액을 결정 하 고는 웹 생산 소요 시간 또한. 또한 웹의 한계 실험에 대 한 정규화 단계를 더 요구 한다 크기 또는 조직 내용에 관하여 다른 폐 조각 사이 불일치가 있습니다. 이 극복 하기 위해 동일한 슬라이스의 비슷한 지역의 생 검 펀치를 생성할 수 있습니다. 이 절차는 조직 변화를 감소 하 고, 추가 혜택으로 실험에 사용할 수 있는 웹 샘플의 수를 증가 하는 경향이.
결론적으로, 인간의 3 차원 폐 조직 문화 agarose에서 가득 웹 폐 생리학을 연구 하 고 질병에 대 한 복잡 한 인간의 모델 제공. 프로토콜 절제 폐 조직 및 그들의 경작에서 웹의 준비에 대 한 자세한 설명을 제공 하 고 또한 인간의 폐 절제술 및 그들을 극복 하는 방법의 agarose 작성에 문제를 해결.
The authors have nothing to disclose.
저자는 전문가 기술 지원을 위한 마리사 노이만에 감사. 모든 폐 조직 했다 친절 하 게 CPC M 바이오-아카이브에 의해 제공. 이 작품은 폐 연구 (DZL), 헬름홀츠 협회와 CPC 연구 학교 보조금의 독일 센터에 의해 지원 되었다.
Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | – | |
Hyrax CU 65 | Zeiss | – | |
Vasofix Braunüle 18G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
30mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | – | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |