Summary

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Published: October 18, 2018
doi:

Summary

Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell’osso in esso.

Abstract

Zebrafish sono in grado di rigenerare i vari organi, tra cui appendici (pinne) dopo l’amputazione. Ciò comporta la rigenerazione dell’osso, che ricresce entro circa due settimane dopo la ferita. Inoltre, zebrafish sono in grado di guarire rapidamente dell’osso dopo la trapanazione del cranio e riparare le fratture che possono essere facilmente introdotto nei raggi della pinna ossuta di zebrafish. Queste analisi di lesioni rappresentano fattibile paradigmi sperimentali per testare l’effetto dei farmaci somministrati su rapidamente formando dell’osso. Qui, descriviamo l’uso di questi modelli di 3 lesioni e loro uso combinato con il trattamento glucocorticoide sistemica, che esercita gli effetti immunosopressivi ed inibitoria dell’osso. Forniamo un flusso di lavoro su come prepararsi per il trattamento immunosopressivo in zebrafish adulto, illustrano come eseguire pinna amputazione, trapanazione delle ossa calvarial e fratture pinna e descrivere come l’uso di glucocorticoidi influenzano entrambi osso formazione osteoblasti e cellule della linea monocito/macrofago come parte dell’immunità innata nel tessuto osseo.

Introduction

Zebrafish rappresentano un potente modello animale per studiare la malattia e lo sviluppo dei vertebrati. Questo è dovuto al fatto che essi sono piccoli animali che si riproducono molto bene e che il loro genoma è completamente sequenziato e suscettibili di manipolazione1. Altri vantaggi includono la possibilità di eseguire imaging continuato dal vivo in diverse fasi, compreso formazione immagine in vivo di zebrafish adulto2e la possibilità di eseguire gli schermi della droga a resa elevata in zebrafish larve3. Inoltre, zebrafish possiedono un’elevata capacità rigenerativa in una varietà di organi e tessuti tra cui osso e così servire come un sistema utile per studiare la malattia scheletrica e riparare4,5.

Osteoporosi indotta da glucocorticoidi (GIO) è una malattia che deriva dal trattamento a lungo termine con glucocorticoidi, ad esempio nel corso del trattamento di malattia autoimmune come l’asma o l’artrite reumatoide. GIO si sviluppa in circa il 30% dei pazienti trattati con glucocorticoidi e rappresenta un problema sanitario importante6; Pertanto, è importante studiare l’impatto di immunosoppressione sul tessuto osseo in grande dettaglio. Negli ultimi anni sono stati sviluppati vari modelli di zebrafish a che fare con la patogenesi di GIO. Perdita dell’osso glucocorticoide-mediata è stata indotta in larve di zebrafish, ad esempio, che ha portato all’identificazione di composti contromisure aumentando la massa di una droga schermo7. Inoltre, gli effetti inibitori dell’osso indotta da glucocorticoidi hanno stati imitati in zebrafish scale sia in vitro che in vivo8,9. Queste analisi sono molto convincenti approcci, soprattutto quando si tratta per l’identificazione di nuovi farmaci immunosoppressivi e osso anabolizzanti. Tuttavia, solo in parte prendono in considerazione l’endoscheletro e non sono stati eseguiti in un contesto rigenerativo. Pertanto, non consentono l’indagine degli effetti glucocorticoide-mediata durante rapida modalità di formazione dell’osso adulto, rigenerativa.

Qui, presentiamo un protocollo che consente ai ricercatori di studiare glucocorticoide-mediata effetti sulle ossa di zebrafish adulto in fase di rigenerazione. Modelli di lesione includono l’amputazione parziale della pinna caudale zebrafish, trapanazione del cranio, così come la creazione delle fratture di pinna ray (Figura 1A-1 C) e sono combinati con glucocorticoidi esposizione tramite incubazione (Figura 1E ). Abbiamo recentemente utilizzato una parte del presente protocollo per descrivere le conseguenze dell’esposizione al prednisolone, uno dei farmaci comunemente prescritti del corticosteroide, il zebrafish adulto rigenerante pinna e cranio osseo10. In zebrafish, gestione di prednisolone porta alla proliferazione degli osteoblasti in diminuzione, differenziazione degli osteoblasti incompleta e rapida induzione dell’apoptosi nel lignaggio del monocito/macrofago10. In questo protocollo, descriviamo anche come fratture possono essere introdotta nella singola aletta ossuta ray segmenti11, come questo approccio può essere utile quando si studia glucocorticoide-mediata effetti sull’osso che si verificano durante la riparazione di frattura. I metodi presentati qui contribuiranno all’ulteriore indirizzo base dei meccanismi di azione glucocorticoide in rapida rigenerazione dell’osso e possono essere impiegati anche in altri contesti sistemica di somministrazione del farmaco nel contesto della rigenerazione dei tessuti di zebrafish.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Landesdirektion di Dresda (permesso di numeri: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87). 1. preparazione dei materiali e delle soluzioni Nota: Prednisolone, come altri glucocorticoidi, conduce all’immunosoppressione. Così, precauzione deve essere presa per prevenire l’infezione negli animali trattati durante l’esperimento. A tal fine…

Representative Results

Il protocollo presentato qui è stato utilizzato ripetutamente per indurre la formazione rapida dell’osso nel corso della rigenerazione del zebrafish pinna e cranio10,11,16. In combinazione con il metodo di somministrazione di prednisolone, studi sugli effetti di prednisolone durante la rigenerazione dell’osso possono essere perseguiti. Ad esempio, studi sulla formazione dell’osso e mineralizzazi…

Discussion

Zebrafish si sono dimostrati utili nella ricerca scheletrico in molti riguardi. Mutanti selezionati imitano gli aspetti della malattia umana come l’osteogenesi imperfetta o osteoartrite23,24,25,26,27, e le larve, come pure le scale vengono utilizzate per identificare composti anabolizzanti osso piccola molecola schermi7,<sup …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del centro di rigenerativa terapie Dresda (“Zebrafish come modello di svelare i meccanismi di perdita dell’osso indotta da glucocorticoidi”) e inoltre da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, progetto 387653785) a FK. Siamo molto grati a Jan Kaslin e Avinash Chekuru per il loro orientamento e assistenza su come eseguire la trapanazione dei calvariae e fratture in raggi della pinna ossuta. Esperimenti sono stati progettati, eseguiti e analizzati da KG e FK. FK ha scritto il manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Katrin Lambert, Nicole Cudak e gli altri membri dei laboratori Knopf e marca per assistenza tecnica e la discussione. Il nostro grazie va anche a Marika Fischer e Jitka Michling per la cura del pesce eccellente e di Henriette Knopf e Josh Currie di correzione il manoscritto per.

Materials

Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3×13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

Referenzen

  1. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  3. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  4. Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
  5. Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
  6. den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
  7. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  8. de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
  9. Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
  10. Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
  11. Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
  12. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  13. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  14. Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
  15. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  16. Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
  17. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  18. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  19. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  20. Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  21. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  22. Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  23. Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
  24. Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
  25. Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Entwicklungsbiologie. 264 (1), 64-76 (2003).
  26. Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
  27. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  28. Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
  29. de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

View Video