वयस्क Zebrafish चोट मॉडल Prednisolone के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अस्थि ऊतक पुनः उत्पन्न करने में
Summary
यहां, हम 3 वयस्क zebrafish चोट मॉडल और immunosuppressive दवा उपचार के साथ उनके संयुक्त उपयोग का वर्णन । हम पुनः उत्पन्न होने वाले ऊतकों के इमेजिंग पर और अस्थि mineralization का पता लगाने पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं ।
Abstract
Zebrafish विच्छेदन के बाद उपांग (पंख) सहित विभिन्न अंगों, पुनर्जीवित करने में सक्षम हैं । यह हड्डी है, जो चोट के बाद लगभग दो सप्ताह के भीतर regenerations के उत्थान शामिल है । इसके अलावा, zebrafish खोपड़ी के trepanation के बाद तेजी से हड्डी को चंगा करने में सक्षम हैं, और मरंमत भंग कि आसानी से zebrafish बोनी फिन किरणों में पेश किया जा सकता है । इन चोट परख व्यावहारिक प्रयोगात्मक मानदंड का प्रतिनिधित्व करने के लिए तेजी से हड्डी बनाने पर प्रशासित दवाओं के प्रभाव का परीक्षण । यहां, हम इन 3 चोट मॉडल और प्रणालीगत glucocorticoid उपचार है, जो हड्डी निरोधात्मक और immunosuppressive प्रभाव डालती के साथ उनके संयुक्त उपयोग के उपयोग का वर्णन । हम कैसे वयस्क zebrafish में immunosuppressive उपचार के लिए तैयार करने के लिए पर एक कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं, समझाने कैसे फिन विच्छेदन, calvarial हड्डियों के trepanation, और पंख भंग करने के लिए, और वर्णन कैसे ग्लुकोकोर्तिकोइद के उपयोग दोनों हड्डी बनाने को प्रभावित करता है osteoblasts और monocyte/मैक्रोफेज वंश की कोशिकाओं अस्थि ऊतक में जन्मजात उन्मुक्ति के भाग के रूप में ।
Introduction
Zebrafish हड्डीवाला विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह तथ्य यह है कि वे छोटे जानवर है कि बहुत अच्छी तरह से नस्ल और है कि उनके जीनोम पूरी तरह से अनुक्रम है और1हेरफेर के लिए उत्तरदाई है की वजह से है । अन्य लाभों में विभिन्न चरणों में जारी लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए विकल्प शामिल हैं, जिसमें vivo इमेजिंग में वयस्क zebrafish2, और zebrafish लार्वा3में उच्च प्रवाह दवा स्क्रीन करने की क्षमता । इसके अतिरिक्त, zebrafish हड्डी सहित अंगों और ऊतकों की एक किस्म में एक उच्च अपक्षयी क्षमता के अधिकारी, और इस तरह एक उपयोगी प्रणाली कंकाल रोग और मरंमत के अध्ययन के रूप में सेवा4,5।
Glucocorticoid-प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस (गियो) एक रोग है कि ग्लुकोकोर्तिकोइद के साथ दीर्घकालिक उपचार से परिणाम, इस तरह के अस्थमा या रुमेटी गठिया के रूप में स्व-प्रतिरक्षित रोग उपचार के दौरान उदाहरण के लिए । गियो glucocorticoid-इलाज रोगियों के बारे में 30% में विकसित और एक प्रमुख स्वास्थ्य6अंक का प्रतिनिधित्व करता है; इसलिए, यह महान विस्तार में अस्थि ऊतक पर प्रतिरक्षादमन के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । हाल के वर्षों में गियो के रोगजनन से निपटने zebrafish मॉडल की एक किस्म विकसित किया गया है । Glucocorticoid-मध्यस्थता हड्डी हानि zebrafish लार्वा में प्रेरित किया गया है, उदाहरण के लिए, जो एक दवा स्क्रीन7में बढ़ती हड्डी द्रव्यमान की पहचान के लिए प्रतिक्रियात्मक यौगिकों के नेतृत्व में. इसके अलावा, glucocorticoid-प्रेरित अस्थि निरोधात्मक प्रभाव zebrafish तराजू में दोनों विट्रो में और vivo8,9में नकल उतारा गया है । इन परख दृष्टिकोण बहुत कायल हैं, खासकर जब यह उपंयास immunosuppressive और हड्डी anabolic दवाओं की पहचान की बात आती है । हालांकि, वे केवल आंशिक रूप से खाते में ले endoskeleton और एक अपक्षयी संदर्भ में नहीं किया गया है । इस प्रकार, वे वयस्क, अपक्षयी अस्थि गठन के तेजी से मोड के दौरान glucocorticoid मध्यस्थता प्रभाव की जांच की अनुमति नहीं है ।
यहां, हम एक शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए अध्ययन करने के लिए glucocorticoid-मध्यस्थ प्रभाव वयस्क zebrafish उत्थान के दौर से गुजर हड्डियों पर । चोट मॉडल zebrafish caudal फिन के आंशिक विच्छेदन, खोपड़ी के trepanation, साथ ही फिन रे भंग (आंकड़ा 1a-1C) के निर्माण में शामिल हैं, और गर्मी के माध्यम से glucocorticoid जोखिम के साथ संयुक्त कर रहे हैं (चित्रा 1E ). हम हाल ही में इस प्रोटोकॉल के एक हिस्से का इस्तेमाल किया है prednisolone, आमतौर पर निर्धारित corticosteroid दवाओं में से एक के लिए जोखिम के परिणामों का वर्णन, वयस्क zebrafish पर फिन और खोपड़ी10अस्थि चूकने । zebrafish में, prednisolone प्रशासन में कमी osteoblast प्रसार, अपूर्ण osteoblast भेदभाव और apoptosis के monocyte/मैक्रोफेज वंश10में तेजी से प्रेरण की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम भी कैसे भंग एकल बोनी फिन रे खंडों11में पेश किया जा सकता का वर्णन है, के रूप में इस दृष्टिकोण फ्रैक्चर की मरंमत के दौरान होने वाली हड्डी पर glucocorticoid मध्यस्थता प्रभाव का अध्ययन करते समय उपयोगी हो सकता है । यहां प्रस्तुत तरीकों को आगे तेजी से पुनः उत्पन्न हड्डी में glucocorticoid कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्र को संबोधित करने में मदद मिलेगी और भी zebrafish ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में प्रणालीगत दवा प्रशासन के अन्य सेटिंग्स में नियोजित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish कई संबंध में कंकाल अनुसंधान में उपयोगी साबित कर दिया है । चयनित म्यूटेंट ऐसे आस्टियोजेनेसिस imperfecta या पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रूप में मानव रोग के पहलुओं की नकल23,24,<sup class="xre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था अपक्षयी चिकित्सा ड्रेसडेन के केंद्र (“Zebrafish के रूप में एक मॉडल के तंत्र को जानने के लिए glucocorticoid-प्रेरित हड्डी हानि”) और इसके अलावा ड्यूश Forschungsgemeinschaft के अनुदान से (Transregio ६७, परियोजना ३८७६५३७८५) ते FK. हम बोनी फिन किरणों में calvariae और फ्रैक्चर के trepanation प्रदर्शन पर उनके मार्गदर्शन और सहायता के लिए जन Kaslin और अविनाश Chekuru के लिए बहुत आभारी हैं । प्रयोगों डिजाइन, प्रदर्शन किया और किलो और FK द्वारा विश्लेषण किया गया । FK ने पांडुलिपि लिखी । हम भी Katrin Lambert, निकोल Cudak, और तकनीकी सहायता और चर्चा के लिए Knopf और ब्रांड लैब्स के अंय सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । हमारा धंयवाद भी उत्कृष्ट मछली की देखभाल के लिए मैरिका फिशर और जितका Michling को जाता है और पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Henriette Knopf और जोश क्यूरी ।
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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