Summary

במבחנה הבידול של העכבר גורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-הפקת תאי T Helper (THGM)

Published: September 10, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להבדיל מאתר granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) תאים מתאי CD4 + T נאיביים, כולל בידוד תאי CD4 + T נאיבי, הבידול של THGM, ו- ניתוח של תאים THGM. בשיטה זו ניתן ליישם לימודי ההוראה ותפקוד תאי THGM.

Abstract

הגורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-ייצור תא T מסייע (THGM) היא תת-קבוצה תא מסייע T שזוהה בעיקר מפריש GM-CSF מבלי לייצר אינטרפרון (IFN) וγ או אינטרלוקין (IL)-17, נמצא לשחק תפקיד חיוני neuroinflammation אוטואימונית. שיטה של בידוד של תמים CD4 + T תאים מתא בודד השעיה של splenocytes ויצירת תא THGM מתאי CD4 + T נאיביים יהיה טכניקה שימושית במחקר של חסינות T תאית ומחלות אוטואימוניות. כאן נתאר שיטת מבדיל בין בעכבר נאיבי CD4 + T תאים לתאי THGM קידום על ידי IL-7. התוצאה של הבידול הוערכה על ידי הניתוח של הביטוי ציטוקינים באמצעות טכניקות שונות, כולל ציטוקין תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), ו מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). כ-55% של התאים באמצעות פרוטוקול בידול THGM כפי שמתואר כאן, הביע GM-CSF עם ביטוי מינימלי של IFNα או IL-17. הביטוי העיקרי של GM-CSF על-ידי תאי THGM אושר עוד יותר על ידי הניתוח של הביטוי של GM-CSF, IFNα ו- IL-17 ברמות ה-mRNA וגם חלבון. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להבדיל תמים CD4 + T תאים THGM תאי במבחנה, אשר יהיה שימושי במחקר של ביולוגיה של התא THGM.

Introduction

תאי CD4 + T helper (TH) הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, יש תפקיד מכריע ההגנה מארח נגד חיידקים פתוגנים, מעקב סרטן, מחלת חיסון עצמי1,2,3. בעת הפעלת קולטן (TCR) תא T, תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מובחן TH1, TH2, TH 17, כתוצאה מתקנות או תאי T (Treg) תחת ההשפעה של ציטוקינים שונים milieus2,4, 5. לאחרונה, ערכה חדשה של תאי TH , המייצרת בעיקר GM-CSF, היה מזוהה, בשם THGM6. הבידול בתאי THGM מונעת על ידי IL-7 באמצעות הפעלת אות מתמר activator של שעתוק 5 (STAT5). תאים אלה אקספרס כמות גדולה של GM-CSF תוך ביטוי נמוך של אחרים TH-תא החתימה ציטוקינים כגון IFNγ ו- IL-176. GM-CSF נמצאה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של CD4 + T תאית neuroinflammation7,8. בהשוואה ל IFNγ – או איל-17-לבטא autoreactive T תאים, GM-CSF-הבעת ‘ T תאים שהועברו אל פראי-סוג עכברים (WT) גרם של תחילת המחלה מוקדם יותר וחומרת המחלה גבוהה יותר. בנוסף, תאי T Csf2– / – נכשלה לזירוז ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) לאחר להיות הועבר adoptively לנמענים WT, ואילו תאי T IFNγ או איל-17A שמר את היכולת לתווך EAE7. יתר על כן, מצור של GM-CSF באמצעות נוגדנים נטרול יושבחו חומרת המחלה EAE8. יתר על כן, מחסור של STAT5 בתאי T בעכברים הביא דור THGM מופחתת ו, לכן, ב התנגדות של העכברים EAE פיתוח6. ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של תאי T GM-CSF-הבעת ‘H neuroinflammatory חיסון למחלה. לפיכך, קביעת שיטה להבדיל בין תאי T GM-CSF-הבעת ‘H מתאי CD4 + T נאיביים יהיה חשוב בחקר בפתוגנזה של neuroinflammation אוטואימונית ותגובות החיסון T תאית. עם זאת, פרוטוקול זה ביעילות מייצר תאי THGM מ מאתר תמים ש-cd4 + לא הוכח.

כאן אנו מציגים שיטה מבדיל בין תאי THGM מאתר מתאי CD4 + T נאיביים. פרוטוקול זה מתאר את כל התהליך, כולל החילוץ של הטחול מהעכבר, ההכנה של השעיה מתא בודד, הבחירה חיובי CD4, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לתא TH בידול וניתוח. התאים helper T הבדיל מנותחים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמה תא יחיד, מאת-אמת ה-PCR כמותי כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמת mRNA, ו מאת אליסה כדי להעריך את הביטוי ציטוקין ברמת חלבון. בשיטה זו ניתן להחיל מחקרים של ביולוגיה של התא THGM בתנאים שונים, כגון EAE, איפה GM-CSF ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה.

Protocol

כל העכברים המשמשים פרוטוקול זה היו על רקע גנטי C57BL/6, תחת תנאים מסוימים ללא הפתוגן באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. כל הניסויים בוצעו באמצעות פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. 1. מגיב והכנת חומרים הכנת 500 מ”ל תמיס…

Representative Results

תאי CD4 + T נאיבי מבודד שני בן שבוע 8 זכר C57BL/6 עכברים חולקו לשלושה חלקים. חלק אחד של התאים היה הבדיל לתאי THGM בעקבות הפרוטוקול המתואר. בחלק אחר היה תרבותי בתנאי THGM בנוכחות נוגדן anti-IL-4 (10 µg/mL) כדי לבחון את השפעת המצור IL-4 הבידול של THGM. החלק האחרון היה תרבותי בתנאי ?…

Discussion

כאן אנחנו תיאר פרוטוקול בידול THGM במבחנה מתאי תמים CD4 + עכבר, ואחריו ניתוח של התאים הבדיל כדי לאמת את השיטה. ראוי לציין, הן הטחול ובלוטות הלימפה יכול לשמש עבור תמים CD4 + תא T טיהור ובידול THGM. הביטוי ציטוקין נקבעים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים בשילוב עם cytometry זרימה הראה כי כ-55% של ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים באוניברסיטה הלאומית לבריאות מערכת של סינגפור (T1-2014 Oct-12 ו T1-2015 Sep-10).

Materials

RPMI 1640 Biowest L0500-500
FBS Heat Inactivated Capricorn FBS-HI-12A
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
10x PBS 1st Base BUF-2040-10 Diluted to 1x PBS in sterile water
EDTA 1st Base BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK buffer Biolegend 420301 diluted in sterile water
cell strainer SPL Life Sciences 93070
CD4 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-201
2-Mercaptoethanol Sigma M7522
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-303
1ml syringe Terumo SS+01T
Centrifuge Eppendorf Eppendorf 5810R
Sony SY3200 cell sorter Sony Sony SY3200 cell sorter
50ml conical centrifuge tube Greiner Bio-One 210261
15m conical centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
FACS tube Corning 352054
24 well cell culture plate Greiner Bio-One 662160
anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0041-82
PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) eBioscience 12-0251-82
anti-human/mouse CD44 APC eBioscience 17-0441-82
anti-mouse CD62L FITC eBioscience 11-0621-85
Neubauer-improved counting chamber Marienfeld 640010
Hyclone Trypan Blue Solution GE healthcare Life Sciences SV30084.01
microscope Nikon Nikon Elipse TS100
Purified anti-mouse CD3e antibody Biolegend 100314
Purified hamster anti-mouse CD28 BD Biosciences 553295
Purified Rat anti-mouse IFNγ   eBioscience 16-7312-85
Purified anti-mouse IL-4 Antibody Biolegend 504102
Recombinant Mouse IL-7 Protein R&D system 407-ML
Recombinant Mouse IL-6 R&D system 406‑ML
recombinant human TGF-beta R&D system 240-B-010
PMA Merck Millipore 19-144
Ionomycin Sigma I0634
GolgiPlug protein transport inhibitor BD Biosciences 51-2301KZ
Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set eBioscience 88-8824-00
anti-mouse GM-CSF PE eBioscience 12-7331-82
FITC anti-mouse IL-17A Biolegend 506908
APC anti-mouse IFN-gamma Biolegend 505810
GO Taq qPCR master mix Promega A6002
mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! invitrogen 88-7334-88
Mouse IL-17A Uncouted ELISA invitrogen 88-7371-22

Referenzen

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Lu, Y., Fu, X., Zhang, Y. In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. J. Vis. Exp. (139), e58087, doi:10.3791/58087 (2018).

View Video