Summary

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Published: August 29, 2018
doi:

Summary

여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.

Abstract

단백질 번역에 동적 변화에 연구 전문된 방법 필요합니다. 여기 우리는 국 소 빈 혈과 reperfusion polysome 프로 파일링과 함께 끼얹는다 절연된 마우스 마음을 사용 하 여 응답에서 새로 합성 된 단백질에 변화를 검사 합니다. 단백질 번역의 동적 변화를 더 이해 하기 우리 mRNAs cytosolic 리보솜 (polyribosomes 또는 polysomes)와 함께 로드 된 또한 미토 콘 드리 아 polysomes 복구 하 고 비교에서 mRNA와 단백질 분포 특징에 높은-효율성 분수 (수많은 리보솜 mRNA에 부착), 낮은-효율성 (적은 리보솜 부착) 또한 미토 콘 드리 아 polysomes, 그리고 번역 비 분수를 포함 하는. miRNAs는 번역 되 고, 번역의 효율성을 줄일 mRNAs와 연결할 수도, 우리는 분수에 걸쳐 miRNAs의 분포를 조사. MRNAs, miRNAs, 및 단백질의 분포는 글로벌 아니 흐름 허 혈과 reperfusion의 30 분 후 30 분 후에 기저 끼얹는다 조건 하에서 시험 되었다. 여기에 우리가이 분석을 수행 하는 데 사용 하는 방법을 제시-특히,이 자당 기온 변화도에서 단백질 추출의 최적화에 대 한 접근은 하지 설명 하기 전에-몇 가지 대표적인 결과 제공.

Introduction

마음은 (I) 허 혈과 reperfusion 동적 방식에서 (R)의 부상에 응답합니다. 그러나, 응답 하는 동안 단백질 합성의 급성 변화에 약간의 통찰력이 있다. 이 해결 하기 위해 우리가 했다 polysome1 단백질 풍부 리보솜 및 polysomes, cytosol에서 변환 규제 요인의 재분배를 반영 하는 변화를 식별 하기 위해 프로 파일링의 기초가 튼튼한 방법의 장점 및 새로 합성된 단백질 (NSPs)에 증가. 나의 설정에서 / R, 새로운 mRNAs2;의 전사와 일치 하지 않는 시간에 발생 하는 새로운 단백질 합성의 증가 또한, mRNA 식 수준 및 단백질 풍부 사이 부조화 보고3되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 동적 프로테옴에서 변경 내용을 분석 하는 단백질 번역에 의해 반영 하기로 결정 했다. 이렇게 하려면, 우리는 polysome 분수에서 mRNA를 계량 하 고 polysome 분수의 단백질 구성을 분석. 마지막으로, microRNAs (미르) 번역에 대 한 mRNAs의 조절 및 단백질 번역4,5의 효율을 방해할 수 있습니다, 때문에 우리 검사 polysome 분수에 미르의 배포에 초점을 맞추고는 내가 응답 / R.

우리는 지속적인 관류, 그리고 국 소 빈 혈 reperfusion의 30 분 뒤의 30 분 30 분 글로벌 아니 흐름 허 혈 후의 기저 상태에서 수확 조직과 격리 마우스 Langendorff 관류 모델을 사용 하기로 결정 했습니다. 우리 심장 조직의 solubilized 그리고 자당 기온 변화도 통해 polysomes를 분리 proteomic 분석 및 선택적 검출 mRNAs와 PCR 및 microarray, miRNAs의 각각 다음. 방법의이 조합은 mRNA, 미르, NSPs의 동시 검출 뿐만 아니라 nontranslating 분수 사이 규제 단백질, 미르, 그리고 mRNA의 재배포 가능 동적 프로테옴을 이해 하는 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 낮은 효율 polysomes, 그리고 높은 효율 polysomes ( 그림 1참조). 이 프로세스의 동적 규칙에 eIF2α 또는 mTOR 등 규제 요인의 인 산화의 더 분석 하 여 연장 됩니다. 이러한 개별 단계 이제 자세히 설명 합니다.

Protocol

모든 동물 연구 기관 지침에 따라 수행 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 했다. 1. Langendorff 마우스 심장의 관류 국 소 빈 혈과 reperfusion 마우스 마음의 Langendorff 관류 관리 복 pentobarbital 나트륨 70 mg/kg 성인 마우스 (8 주 오래 된, 남성, C57BL6/j). 핀치를 발 끝에 철수의 부족에 의해 깊은 마 취를 확인 합니다.</li…

Representative Results

mRNA 분석mRNA 결과 각 분수 (그림 3A); 특정 mRNA의 배포로 표현 될 수 있습니다. 정량화, polyribosomal 번역 분수를 결합 하 고 nontranslating 분수 번역 mRNA 풍부의 비율을 제시 번역 비 분수 (그림 3B), 비교. 추가 정보는 별도로에서 낮은 효율 polysome 분수 (그리고 nontranslating 분수에서 별도) 고효율 polysome 분수를 검사 하 여 얻었?…

Discussion

Polysome 프로필 분석 특정 mRNA 또는 전체 transcriptome6,7의 변환 상태를 분석 하 여 단백질 번역의 연구에 대 한 수 있습니다. 그것은 또한 큰 도움이 현지 번역 synaptosomes8같은 공부 될 필요가 있을 때입니다. 전통적으로,이 방법은 모노-및 polyribosomes 및 자당 그라디언트는 수와 결합 게놈 또는 의도 된 결과6,<sup clas…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH P01 HL112730 (걸 레, JVE), NIH R01 HL132075 (걸 레, JVE), 바브라 스 트라이 샌드 여자의 심장 센터 (걸 레, JVE), 도로시와 E. 필립 리옹 분자 심장 (걸 레)에서 자, 에리카 글 레이저 부여 여성의 심장 건강 (JVE)에 체코 과학 아카데미의의 자 제도적 지원 RVO: 68081715 (MS)

Materials

Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO4 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

Referenzen

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Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

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