Summary

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Published: July 29, 2018
doi:

Summary

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Abstract

Myeloïde voorlopercellen dat de opbrengst van neutrofiele granulocyten, monocyten en dendritische cellen (DC’s) kunnen worden geïdentificeerd in en geïsoleerd uit het beenmerg van muizen voor hematologische en immunologische analyses. Bijvoorbeeld, kunnen studies naar de cellulaire en moleculaire eigenschappen van myeloïde voorlopercellen populaties onthullen mechanismen ten grondslag liggen aan de leukemische transformatie, of aantonen hoe het immuunsysteem reageert pathogen blootstelling. Eerder beschreven stroom cytometry strategieën voor identificatie van myeloïde voorlopercellen vooruitgang op vele terreinen hebt ingeschakeld, maar de breuken die zij identificeren zijn zeer heterogeen. De meest gebruikte gating strategieën definiëren beenmerg breuken die voor de gewenste populaties zijn verrijkt, maar ook grote aantallen van voorlopercellen “besmetten” bevatten. Onze recente studies hebben veel van deze heterogeniteit, opgelost en het protocol die wij hier presenteren toelaat het isolement van 6 subpopulaties van oligopotent en lineage-begaan myeloïde voorlopercellen van 2 eerder beschreven beenmerg breuken. Het protocol beschrijft 3 fasen: 1) isolatie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen door magnetische-geactiveerde cel sorteren (lineage uitputting door MACS) en 3) de identificatie van myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen door stroom cytometry (met inbegrip van fluorescentie-geactiveerde cel sorteren, FACS, indien gewenst). Deze aanpak toelaat voorlopercellen kwantificering en isolatie voor allerlei toepassingen in vitro en in vivo , en al nieuwe inzicht in trajecten en mechanismen van neutrofiele monocyt en DC differentiatie heeft opgeleverd.

Introduction

Monocyten, neutrofielen en dendritische cellen (DC’s) zijn myeloïde cellen die uit hematopoietische progenitorcellen, voornamelijk in het beenmerg, door een proces genaamd myelopoiesis voortvloeien. Gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs) hebben het potentieel om te produceren myeloïde cellen, evenals megakaryocytes en erytrocyten, maar niet lymfoïde cellen. Granulocyt-monocyt progenitoren (GGP’s), die zijn afgeleid van CMPs, produceren granulocyten en monocyten, maar Megakaryocyt en erytrocyt potentiële hebben verloren. Monocyten en klassieke en plasmacytoid DCs (cDCs/PDC’s) wordt ook gedacht dat ze voortvloeien uit gemeenschappelijk progenitoren bekend als monocyt-DC progenitoren (MDP’s), die worden geproduceerd door CMPs. geleidelijke beperking van de bloedlijn potentieel uiteindelijk in de bloedlijn-gepleegd resulteert progenitoren: granulocyt progenitorcellen, monocyt progenitoren en dendritische cel progenitoren (Figuur 1).

Weissman en collega’s gemeld dat CMPs zijn gevonden in de Lin c-Kit+ Sca-1 (LKS) CD34+ FcγRlo Fractie van muis beenmerg, terwijl GGP’s zijn opgenomen in de LKS -CD34+ FcγR Hallo breuk1. Deze “CMP” en “GMP” breuken zijn echter zeer heterogeen. Bijvoorbeeld, bevat de “GMP” breuk ook lineage-begaan granulocyt progenitoren en monocyt progenitoren1,2. MDP’s gemeld afzonderlijk te worden CX3CR1+ Flt3+ CD115+ progenitoren die ook uitdrukking geven aan CD34 en FcγR3,4. MDP’s aanleiding geven tot cDC/pDC-producerende gemeenschappelijk DC progenitoren (CDP’s), die zijn gemeld bij het uiten van lagere niveaus van c-Kit (CD117) en zijn niet opgenomen in de LKS deel5.

Eerder werd aangenomen dat de monocyten ontstaan via een enkel traject (CMP-GMP-MDP-monocyt). Overeenstemming is met dit model, monocyt-begaan progenitoren geproduceerd door GGP’s (genaamd monocyt progenitorcellen, MPs)2 en MDP’s (genoemd gemeenschappelijk monocyt progenitorcellen, cMoPs)6 lijken te zijn dezelfde cellen op basis van gedeelde oppervlakte marker expressie . Echter we onlangs aangetoond dat monocyten onafhankelijk worden geproduceerd door GGP’s en MDP’s, en waren in staat om onderscheid te maken tussen MPs en cMoPs door eencellige RNA sequencing7.

We hebben onlangs gewijzigd de Weissman “CMP” en de “GMP” gating strategie ter identificatie van de 6 subfractions van C57BL/6J muis beenmerg met verschillende oligopotent en geslacht-begaan myeloïde voorlopercellen deelverzamelingen. We eerst gemeld dat kleuring voor Ly6C en CD115 het isolement van oligopotent GGP’s, evenals granulocyt progenitoren (GPs) en monocyt progenitoren (zowel MPs als cMoPs, die wij op dit moment niet te scheiden) vergunningen van de “GMP” breuk2 (LKS CD34+ FcγRHallo poort; Figuur 1). Wij vervolgens aangetoond dat MDP’s voornamelijk te in de “CMP” breuk vinden zijn (LKS CD34+ FcγRlo gate), waarin ook Flt3+ CD115lo en Flt3 deelverzamelingen7 (Figuur 1 ). De CMP-Flt3+ CD115lo breuk levert zowel GGP’s en MDP’s bij adoptief overdracht. De CMP-Flt3 -subset bevat progenitoren die lijken te zijn van tussenproducten tussen CMP-Flt3+ CD115lo cellen en GGP’s. In tegenstelling tot MDP’s, zowel de CMP-Flt3+ CD115lo en CMP-Flt3 fracties ook beschikken over Megakaryocyt en erytrocyt potentiële.

Het is belangrijk op te merken echter dat er op dit moment onduidelijk of de fracties “CMP” progenitoren die echt zijn oligopotent (bijvoorbeeld individuele cellen binnen de CMP-Flt3+ CD115lo breuk die neutrofiele bezitten, bevatten monocyt, DC, Megakaryocyt en erytrocyt potentiële), of als alternatief, bestaan uit een mengsel van progenitoren met beperktere lineage potentieel. Kolonievormende assays (methylcellulose culturen) geopenbaard cellen met granulocyt (neutrofiele), erytrocyt, monocyt en Megakaryocyt potentiële (GEMM cellen) in de “CMP”, CMP-Flt3+ CD115lo en breuken van de CMP-Flt3 1 ,7, maar niet mogelijk is de evaluatie van DC kansen. In tegenstelling, kolonievormende testen aangetoond dat het bestaan van oligopotent GGP’s (progenitoren met neutrofiele én monocyt potentiële) in de “GMP” breuk1,2, en dit wordt ondersteund door recente eencellige Transcriptomic analyse8. Het is niet momenteel bekend, echter of deze oligopotent GGP’s ook andere granulocyten (eosinofielen, basofielen en mast cellen produceren).

Op basis van deze studies, we laten nu zien kunnen hoe 7 oppervlakte markeringen (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C en CD115) worden gebruikt om te identificeren en deze 6 deelverzamelingen van oligopotent en myeloïde voorlopercellen lineage-begaan te isoleren. Het protocol hier beschreven kan worden toegepast voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten in muizen en moleculaire analyse (bulk en eencellige RNA sequencing, westelijke bevlekken, etc.).

Het protocol bestaat uit 3 fasen: 1) voorbereiding van een enkele celsuspensie van beenmerg cellen, 2) verrijking voor hematopoietische progenitorcellen (magnetische-geactiveerde cel Sorteren), en 3) identificatie en isolatie, indien gewenst, van voorlopercellen deelverzamelingen door stroom Cytometry (met een analyzer of een sorteerder, voorkomend). De eerste stap is het isolement van beenmergcellen van het dijbeen en zijn verbeend euthanized muizen en is vergelijkbaar met andere eerder beschreven protocollen9. Vervolgens wordt het monster verrijkt voor stuurpen en voorlopercellen cellen met behulp van een cocktail van antilichamen tegen cel oppervlakte markers van erytrocyten, neutrofiele granulocyten, monocyten, lymfocyten, enz., tot het afbreken van de gedifferentieerde cellen. Dit is niet verplicht, maar sterk aanbevolen voor het optimaliseren van de detectie van de deelverzamelingen van voorlopercellen, en aan het verminderen van de hoeveelheid antilichamen nodig voor identificatie van voorlopercellen en de tijd die nodig is voor de stroom cytometry. Het geslacht uitputting protocol hieronder beschrijft Magnetic-Activated cel sorteren (MACS) met behulp van een muis Lineage cel uitputting Kit (waarin biotinyleerd antilichamen tegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, en Ter-119, plus anti-Biotine microbeads) en een geautomatiseerde magnetische scheidingsteken. De laatste stap is de identificatie (en sorteren, indien gewenst) van de voorvader deelverzamelingen door stroom cytometry. Het antilichaam paneel hieronder beschreven (Zie ook tabel 1) is ontwikkeld om te worden gebruikt in een flow cytometer (analyzer of diasorteerderweergave) met 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figure 1
Figuur 1: neutrofiele, monocyt en DC progenitoren en differentiatie trajecten. De onlangs herziene model van myelopoiesis7 is geïllustreerd, met de Weissman-poorten voor “CMPs” (blauw) en “GGP’s” (groen)1 bedekt. Dit cijfer is gewijzigd van Yáñez et al. 20177. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Cedars-Sinai Medical Center. 1. isolatie van muis beenmerg en voorbereiding van een schorsing van één cel De muis overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele euthanaseren. Plaats de euthanized muis op zijn rug en spuiten met 70% ethanol (EtOH). Het maken van een kleine (3-5 mm) incisie in elke hind-limb op de enkel niveau met behulp van sche…

Representative Results

Met het protocol zoals hierboven beschreven, is het mogelijk te krijgen van ~ 100 miljoen cellen (met inbegrip van de rode bloedcellen of ~ 50 miljoen genucleëerde cellen) van zowel dijbeen en zijn verbeend (2 benen) van een C57BL/6J muis (6-8 weken oud, man of vrouw). 1-2 miljoen Lin- cellen kunnen worden geïsoleerd per muis door MACS uitputting van Lin+ cellen. – Cellen vormt elk van de 6 mye…

Discussion

De gating strategie voor muis myeloïde voorlopercellen identificatie1 Weissman is de gouden standaard voor immunologen en Haematogen voor bijna 20 jaar, maar het is nu duidelijk dat de “CMP” en “GMP” poorten zeer heterogene en nauwkeuriger gating strategieën nodig. Het protocol dat wij hier hebben beschreven maakt de identificatie van oligopotent en geslacht-begaan deelverzamelingen in C57BL/6J muizen voor meer precieze kwantificering van specifieke myeloïde voorlopercellen en myelopoiesis traj…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van fondsen van de Raad van gouverneurs regeneratieve geneeskunde Instituut in het Cedars-Sinai Medical Center (HSG), een carrière in immunologie fellowship van de Amerikaanse vereniging van immunologen (aan AY en HSG) en een geleerde Award uit de American Society of Hematology (aan AY). Wij danken de Stroom Cytometry kern in het Cedars-Sinai Medical Center voor hulp bij FACS sorteren.

Materials

Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) The Jackson Laboratories Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, mouse Miltenyi Biotec Cat#130-090-858
Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC BD Biosciences Cat#553733
Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 BioLegend Cat#101327
Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 BioLegend Cat#108114
Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue BioLegend Cat#105820
Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 BioLegend Cat#128012
Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE BioLegend Cat#135506
Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC BD Biosciences Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads Thermo Fisher Scientific Cat#C36950
AutoMACS Separator Miltenyi Biotec N/A Use the "deplete" program
BD LSRFortessa BD Biosciences N/A 5 lasers, 15 colors
BD FACS Aria III cell sorter BD Biosciences N/A 5 lasers, 13 colors
FlowJo FlowJo, LLC https://www.flowjo.com For further analysis of the .fcs files

Referenzen

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
  2. Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
  3. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
  4. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
  5. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
  6. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
  7. Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
  8. Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
  9. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  10. Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
  11. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Yáñez, A., Goodridge, H. S. Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (137), e58061, doi:10.3791/58061 (2018).

View Video