تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل وتوصيف هيكل وفاعلية حاسة الشم، والاستجابة السلوكية للمركبات فرمون المفترضة للبحر الشلق.
Abstract
تجزئة تسترشد الحشري هو نهج تكرارية وتستخدم نتائج المقايسة الفسيولوجية والسلوكية لإرشاد عزل وتحديد مجمع فرمون النشطة. أدى هذا الأسلوب توصيف ناجحة من الإشارات الكيميائية التي تعمل الفيرومونات في طائفة واسعة من الأنواع الحيوانية. الشلق البحر تعتمد على أولفاكشن للكشف عن الفيرومونات التي تتوسط الاستجابات الفسيولوجية أو السلوكية. نحن نستخدم هذه المعرفة لبيولوجيا الأسماك إلى افتراض وظائف الفيرومونات المفترضة وتوجيه عزل وتحديد المكونات النشطة فرمون. يتم استخدام اللوني لاستخراج وتركيز وفصل المركبات من الماء المكيفة. وتجري التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) لتحديد الكسور التي الحصول على ردود حاسة الشم. ثم تستخدم فحوصات السلوكية المتاهة الخيار الثاني لتحديد إذا كان أي من الكسور معطر أيضا تنشط سلوكيا والحث على تفضيل. توفير أساليب والمطيافيه والطيفية الوزن الجزيئي والمعلومات الهيكلية للمساعدة توضيح هيكل. ويؤكد بيواكتيفيتي المركبات النقية مع EOG وفحوصات السلوكية. يجب التحقق من الاستجابة السلوكية التي لوحظت في متاهات في إعداد حقل لتأكيد وظيفتها في أجواء طبيعية تيار في نهاية المطاف. هذه المقايسة بدور مزدوج 1) توجيه عملية تجزئة و 2) تأكيد وزيادة تحديد بيواكتيفيتي المكونات المعزولة. هنا، نحن تقريرا عن نتائج الممثل لتعريف فرمون لامبرى البحر التي تمثل الأداة نهج تجزئة تسترشد الحشري. تحديد الفيرومونات لامبرى البحار أهمية خاصة نظراً لتعديل نظامها للاتصالات فرمون من بين الخيارات التي نظرت للتحكم لامبرى البحر الغازية في منطقة “البحيرات الكبرى اللورنثيه”. هذا الأسلوب يمكن تكييفها مع سهولة وصف البلاغ الكيميائي في طائفة واسعة من الأنواع وتسليط الضوء على الإيكولوجيا الكيميائية المنقولة بالمياه.
Introduction
الفيرومونات هي محددة الإشارات الكيميائية الصادرة عن الأفراد بمساعدتها في تحديد مصادر الغذاء، والكشف عن الحيوانات المفترسة والتوسط في التفاعلات الاجتماعية من كونسبيسيفيكس1. وقد تم الاتصال فرمون في الحشرات2من درس جيدا؛ بيد أن تحديد الهوية الكيميائية والبيولوجية الفيرومونات الفقاريات المائية لم تدرس على نطاق واسع. يمكن تطبيق معرفة هوية ووظيفة الفيرومونات الإفراج عن تيسير انتعاش الأنواع المهددة بالانقراض3،4 أو مكافحة الآفات الأنواع5،6. ويقتضي تطبيق هذه التقنيات بعزل وتوصيف المكونات النشطة بيولوجيا فرمون.
تعريف فرمون فرع من كيمياء المنتجات الطبيعية. التقدم في البحوث فرمون اقتصر جزئيا بسبب طبيعة الجزيئات فرمون أنفسهم. الفيرومونات غالباً ما تكون غير مستقرة، وتم إصدارها بكميات صغيرة، وتوجد سوى عدد قليل من تقنيات أخذ العينات للكشف عن المبالغ الدقيقة المتطايرة7،8 أو9من المركبات للذوبان في الماء. وتشمل النهج تحديد الفيرومونات 1) لفحص مستهدفة المركبات المعروفة، 2) جميع، ووجود 3) الموجهة بالعينة. اختبارات لفحص مستهدفة من المركبات المعروفة المتاحة تجارياً الآثار الجانبية الأيضية للعمليات الفسيولوجية التي افترض أن تعمل الفيرومونات. هذا النهج هو الحد للباحثين فقط اختبار المركبات المعروفة والمتاحة. ومع ذلك، أنها أدت في تحديد نجاح الهرمونات الجنسية في ذهبية تلك الوظيفة الفيرومونات10،،من1112. جميع هو نهج تحديد فرمون ثانية التي تميز المنتجات الأيضية جزيء صغير المحتملة داخل نظام البيولوجي13. مقارنة بين التشكيلات الجانبية الأيضية للفريقين (أينشاط مقابل مقتطف غير نشطة) يمكن تحديد تشكيل جانبي الأيضية المحتملة من الذي يتم تنقيته في المستقلب، هو توضيح الهيكل، بيواكتيفيتي هو تأكيد14. الآثار المضافة أو التآزر تركيبات معقدة من الخلائط محددة أكثر من المحتمل أن يكون اكتشاف مع جميع لأنها تعتبر نواتج الأيض معا وليس كسلسلة من الكسور13. حتى الآن، تنفيذ جميع يعتمد على توافر المراجع الاصطناعية لأن البيانات الناتجة لا تيسر الكشف عن هياكل جديدة.
تجزئة تسترشد الحشري هو نهج متكامل وتكرارية يمتد على حقلين: الكيمياء وعلم الأحياء. يستخدم هذا النهج نتائج المقايسة الفسيولوجية والسلوكية لإرشاد عزل وتحديد مجمع فرمون النشطة. استخراج النفط خام هو مجزأ حسب خاصية كيميائية (أي، حجم الجزيئية، قطبية، إلخ) واختبارها مع التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) و/أو العينة. يتم فحص المكونات النشطة بيولوجيا بتكرار هذه الخطوات لتجزئة وأوجس و/أو المقايسة. يتم توضيح هياكل المركبات النشطة نقية بأساليب والمطيافيه والطيفية، التي توفر الوزن الجزيئي والمعلومات الهيكلية لإنتاج قالب من المجمع لتوليف. يمكن أن تسفر عن وجود تسترشد الحشري والايضات المتنوعة، ويحتمل أن تكون رواية الفيرومونات مع الهياكل العظمية الكيميائية الفريدة التي من غير المحتمل أن التنبؤ بمسارات السكروز.
هنا، يمكننا وصف تجزئة تسترشد الحشري البروتوكول المستخدم لعزل وتوصيف بيواكتيفيتي المركبات فرمون الجنس الذكور البحر لامبرى. لامبرى البحر (مارينوس Petromyzon) نموذج فقاريات مثالية لدراسة الاتصالات فرمون لهذه الأسماك تعتمد بشكل كبير على اكتشاف حاسة الشم من الإشارات الكيميائية للتوسط في تاريخهم الحياة البحرية النهرية السرء وتتألف من ثلاث مراحل متميزة: اليرقات والأحداث والبالغين. لامبرى البحر تحفر اليرقات في الترسبات مجاري المياه العذبة، وتمر تحول جذري، وتحويل الأحداث التي تهاجر إلى البحيرة أو المحيط حيث أنهم شوش السمك المضيف كبيرة. بعد فصلها من السمك المضيف، ترحيل البالغين إلى تيارات التفريخ، تسترشد الفيرومونات المهاجرة الإفراج اليرقات المقيم في تيار15،16،،من1718،19 . الذكور الناضجة تصعد إلى حديقة التفريخ، وإطلاق سراح من فرمون جنس متعدد عناصر جذب الأصحاب وتفرخ بشكل متقطع لمدة أسبوع تقريبا ثم يموت15،20. تحديد الفيرومونات لامبرى البحر مهم لتعديل نظام الاتصالات فرمون من بين الخيارات التي نظرت للتحكم الشلق البحر الغازية في “البحيرات الكبرى اللورنثيه”21.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسماك تعيش في عالم الكيميائي كامل للمركبات بعد تحديد. ثبت تسترشد الحشري تجزئة أساسية لتحديد وتوصيف النشطة بيولوجيا الجزيئات التي تتوسط العديد من التفاعلات الكيميائية، مثل تلك التي لوحظت في سمك السلمون masu31والفيلة الآسيوية32الشلق البحر33، …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الولايات المتحدة الجيولوجية المسح هاموند خليج البيولوجية المحطة لاستخدام مرافقها البحثية وموظفي الولايات المتحدة للأسماك والأحياء البرية ومصائد الأسماك والمحيطات في كندا لتوفير الشلق البحر. وأيد هذا البحث المنح المقدمة من “لجنة مصايد الأسماك في البحيرات العظمى” للي ويي، ولي كه.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
Referenzen
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -. n., Wen, P., Dong, S. -. h., Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. . Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. . Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour?. Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -. Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. . Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. . Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
