Murine मॉडल में Utero ट्रांसप्लांटेशन में नसों और इंट्रा-एमनियोटिक
Summary
हम नसों और murine मॉडल में इंजेक्शन के इंट्रा-एमनियोटिक मार्गों के माध्यम से utero प्रत्यारोपण (IUT) में एक प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल अद्वितीय प्रतिरक्षा सहिष्णु भ्रूण वातावरण में कोशिकाओं, वायरल वैक्टर, और अंय पदार्थों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
utero ट्रांसप्लांटेशन (IUT) में चिकित्सा कि स्टेम सेल, वायरल वैक्टर, या किसी भी अंय पदार्थों जल्दी हमल में शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अद्वितीय और बहुमुखी मोड है । चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए IUT के पीछे तर्क भ्रूण के छोटे आकार पर आधारित है, भ्रूण immunologic अपरिपक्वता, भ्रूण स्टेम या जनक कोशिकाओं की पहुंच और प्रफलन प्रकृति, और एक रोग या लक्षणों की शुरुआत का इलाज करने की क्षमता जंम से पहले । भ्रूण के इन सामान्य विकास के गुणों का लाभ उठाते हुए, एक IUT के माध्यम से टेम स्टेम सेल (HSC) के वितरण की आवश्यकता के बिना सिकल सेल रोग जैसे जन्मजात hematologic विकारों का इलाज करने की क्षमता है जन्मोत्तर HSC प्रत्यारोपण के लिए myeloablative या immunosuppressive कंडीशनिंग आवश्यक है । इसी प्रकार, विकास के दौरान कई अंगों में जनक कोशिकाओं की पहुंच संभावित जीन थेरेपी या जीनोम संपादन के लिए वायरल वैक्टर के एक IUT के बाद स्टेम/जनक कोशिकाओं के एक अधिक कुशल लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, IUT सहित सामांय विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन सीमित नहीं है, immunologic सहिष्णुता के विकास । murine मॉडल एक मूल्यवान और सस्ती IUT की क्षमता और सीमाओं को समझने के पूर्व नैदानिक बड़े पशु अध्ययन और एक अंतिम नैदानिक आवेदन करने के लिए साधन प्रदान करता है । यहां, हम नसों और इंट्रा एमनियोटिक मार्गों के माध्यम से murine भ्रूण में एक IUT प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के लिए आवश्यक शर्तों और utero टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, सहनशीलता प्रेरण में पीछे तंत्र स्पष्ट, और utero जीन थेरेपी में ।
Introduction
प्रसवपूर्व स्क्रीनिंग और निदान में हाल ही में अग्रिमों जन्मजात विकारों जो पर्याप्त जन्मोत्तर उपचार के विकल्प और महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर में परिणाम नहीं है की एक संख्या के लिए भ्रूण के इलाज की संभावना को प्रकाश में लाया है । विशेष रूप से, utero टेम स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण में (IUHCT) और जीन चिकित्सा/जीनोम संपादन करने के लिए भ्रूण के सामांय विकासात्मक गुणों का लाभ लेने के लिए जंमजात hematologic, प्रतिरक्षा, और आनुवंशिक का इलाज करने की क्षमता है जन्मोत्तर HSC प्रत्यारोपण और जीन थेरेपी से अधिक कुशलता से विकारों/जीनोम संपादन1,2कर सकते हैं । विशेष रूप से, भ्रूण के छोटे आकार के कारण, दाता कोशिका या वायरल वेक्टर खुराक प्राप्तकर्ता के वजन के अनुसार अधिकतम किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, भ्रूण की immunologic अपरिपक्वता दाता HSCs myeloablative और immunosuppressive कंडीशनिंग कि जन्मोत्तर प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल में आवश्यक है बिना इंजेक्शन हो सकता है । इसी तरह, वायरल वैक्टर एक चिकित्सीय transgene या जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी ले जाने के लिए या तो transgene उत्पाद या वायरल वेक्टर एक सीमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बिना इंजेक्ट किया जा सकता है । अंत में, भ्रूण स्टेम/जनक कोशिकाओं की पहुंच और प्रफलन प्रकृति लक्ष्य जनक कोशिकाओं की एक अधिक कुशल transduction की संभावना है, साथ ही जीनोम संपादन के कुछ तरीके (समरूपता-मरंमत निर्देशित) जो साइकिल चालन की आवश्यकता कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक होने के लिए । murine मॉडल के रूप में कार्य करता है एक व्यावहारिक और सस्ती करने के लिए स्टेम सेल जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी में महत्वपूर्ण सवालों के पूर्व नैदानिक बड़े पशु मॉडल में प्रयोग करने से पहले और पता है, जैसे, प्राथमिक मॉडल के रूप में सेवा की है जिसमें IUHCT और utero में जीन थेरेपी में1,2,3का पता लगाया गया है ।
हालांकि कई चर IUHCT की सफलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और utero जीन थेरेपी में/murine और बड़े पशु मॉडल में जीनोम संपादन, एक महत्वपूर्ण चर HSCs या वायरल वेक्टर के वितरण की विधि है । भ्रूण जिगर में होने वाले पहले से गुजारें प्रभाव के साथ दाता HSCs की बड़ी खुराक का वितरण, IUHCT के समय में टेम अंग, माउस और बड़े पशु मॉडल में engraftment के macrochimeric स्तर को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होने के लिए दिखाया गया है4 ,5. यह माउस मॉडल में vitelline नस और कुत्ते मॉडल में एक इंट्रा कार्डियक इंजेक्शन के माध्यम से दाता कोशिकाओं के एक इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया गया था । इंजेक्शन का मार्ग भी विकास के दौरान विभिन्न अंगों की जनक कोशिकाओं को लक्षित करने में एक मौलिक भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, vitelline नस के माध्यम से एक नसों में इंजेक्शन एक देर से हमल इंजेक्शन6,7के बाद कुशलता से transduce cardiomyocytes और हेपैटोसाइट्स करने के लिए दिखाया गया है । वैकल्पिक रूप से, वायरल वैक्टर के एक इंट्रा एमनियोटिक इंजेक्शन अंगों के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है कि शारीरिक रूप से भ्रूण तह के आधार पर उजागर कर रहे हैं/ इस एमनियोटिक में वायरल वेक्टर के लिए श्वसन तंत्र को उजागर करता है जो सामान्य भ्रूण “श्वास” आंदोलनों, का लाभ लेने के लिए देर से एक इंट्रा-एमनियोटिक इंजेक्शन के माध्यम से श्वसन उपकला के लक्ष्यीकरण द्वारा सबसे अच्छा उदाहरण है द्रव9. IUT के इन दो मोड, vitelline नस और इंट्रा एमनियोटिक के माध्यम से नसों में, हमारी प्रयोगशाला में कई अतीत और चल रहे प्रयोगों के लिए आधार किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से murine मॉडल में नसों में और इंट्रा-एमनियोटिक IUT प्रदर्शन के लिए तरीकों का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
utero प्रत्यारोपण में कई जंमजात विकारों कि जल्दी हमल में निदान किया जा सकता है के लिए एक संभावित चिकित्सा है । IUT के लिए murine मॉडल शोधकर्ताओं भ्रूण पर्यावरण का पता लगाने के लिए या विभिन्न उपचारों के साथ प्?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Referenzen
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