Мы описываем протокол для проведения трансплантации в утробе матери (ИТУ) посредством внутривенного и интраамниальной маршруты инъекции в мышиных модели. Этот протокол может использоваться для внедрения клетки, вирусных векторов и других веществ в уникальной иммунной терпимо плода среду.
В утробе матери трансплантации (ИТУ) — это уникальный и универсальный режим терапии, которые могут использоваться для введения стволовых клеток, вирусных векторов или любых других веществ в начале беременности. Обоснование ИТУ для терапевтических целей основывается на небольшой размер плода, иммунологические незрелость плода, доступности и пролиферативной характер фетальных стволовых и прогениторных клеток и потенциал для лечения болезни или появления симптомов до рождения. Принимая преимущества этих обычных свойств развития плода, доставки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) через ИТУ имеет потенциал для лечения врожденной гематологических расстройств, таких как серповидно-клеточной анемией, без необходимости myeloablative или иммуносупрессивные принадлежности, необходимые для послеродового HSC трансплантации. Кроме того доступность прогениторных клеток в нескольких органах во время разработки потенциально позволяет для более эффективной ориентации стволовых/прогениторных клеток после ИТУ вирусных векторов для генной терапии или изменения генома. Кроме того ИТУ может использоваться для изучения нормальных процессов развития, в том числе, но не ограничиваясь, развития иммунологической толерантности. Мышиных модель обеспечивает ценные и доступные средства для понимания потенциал и ограничения ИТУ до доклинические исследования на крупных животных и последующего клинического применения. Здесь мы описываем протокол для выполнения ИТУ в мышиных плода посредством внутривенного и интраамниальной маршрутов. Этот протокол успешно использовался для выяснения необходимые условия и механизмы, лежащие в утробе матери трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, индукции толерантности и в утробе матери генной терапии.
Последние достижения в пренатальный скрининг и диагностика высветили возможность лечения плода для ряда врожденных расстройств, которые не имеют надлежащего послеродового лечения и приводят к значительным заболеваемости и смертности. В частности в утробе матери трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (IUHCT) и генной терапии/генома редактирования имеют потенциал воспользоваться нормального развития свойств плода для лечения врожденной, гематологические, иммунной и генетических расстройства более эффективно, чем послеродовой трансплантации ГСК и генной терапии/генома редактирования можно сделать1,2. В частности из-за небольшого размера плода, доноров клеток или вирусный вектор доза может быть максимально повышена весу получателя. Кроме того иммунологические незрелость плода позволяет доноров СКК для инъекций без myeloablative и иммуносупрессивные кондиционирования, что требуется в послеродовой трансплантации протоколы. Аналогичным образом вирусных векторов, перевозящих терапевтических трансген или редактирования технологии генома могут быть введены без ограничения иммунного ответа трансген продукта или вирусный вектор. Наконец доступность и пролиферативной характер плода стволовых/прогениторных клеток дают возможность более эффективно трансдукции прогениторных клеток-мишеней, а также определенных видов генома редактирования (ориентированные на гомологии ремонта), которые требуют Велоспорт клетки происходят эффективно. Мышиных модель служит глубокий и доступным средством для решения важных вопросов в клеточной биологии и иммунологии до экспериментировать в доклинических моделях крупных животных и, таким образом, служил в качестве основной модели в которых IUHCT и в матке терапия гена были изучены1,2,3.
Хотя многие переменные играют важную роль в успехе IUHCT и в утробе матери генной терапии/генома редактирования в мышиных и крупных животных моделях, ключевой переменной является метод доставки СКК или вирусный вектор. Доставка больших доз донорских СКК с эффектом первого прохода, происходящих в фетальной печени, гемопоэтических органа во время IUHCT, было показано, быть важную роль в достижении уровня macrochimeric приживления в мышь и большие животные модели4 ,5. Это было достигнуто посредством инъекции доноров клеток через vitelline вен в модель мыши и через укол внутри сердца в собачьей модели. Маршрут впрыска также играет основополагающую роль в ориентации прогениторных клеток различных органов во время разработки. Например внутривенные инъекции через vitelline вен доказано эффективно передают кардиомиоцитов и гепатоцитов после поздней беременности инъекции6,7. Кроме того инъекция интраамниальной вирусных векторов позволяет ориентации органов, которые физически подвергаются во время инъекции8на основе эмбриональных складные/развития. Наилучшим примером является ориентация эпителия дыхательных через инъекцию интраамниальной в конце беременности воспользоваться нормальной движений плода «дышать», который предоставляет дыхательных путей в вирусный вектор в амниотической жидкости9. Эти два режима ИТУ, внутривенно через vitelline вен и интраамниальной, были основой для нескольких прошлых и нынешних экспериментов в нашей лаборатории. В этом протоколе мы подробно описать методы для выполнения внутривенного и интраамниальной ИТУ в мышиных модели.
В утробе матери трансплантации является потенциальной терапии для многих врожденных расстройств, которые могут быть диагностированы в начале беременности. Мышиных модель ИТУ позволяет исследователям изучить плода окружающей среды или экспериментировать с различных видов тера?…
The authors have nothing to disclose.
Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
Tape | 3M | 1527-1 | |
Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
Heating Pad | K&H | 3060 | |
Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
Injector | Narishige | HI01PK01 | |
Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
Insulin Syringe | BD | 305935 | |
Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
N2 gas | Airgas | NI 125 | |
O2 gas | Airgas | OX 125 | |
Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |