Summary

Внутривенно и интраамниальной In Utero трансплантации мышиных модели

Published: October 09, 2018
doi:

Summary

Мы описываем протокол для проведения трансплантации в утробе матери (ИТУ) посредством внутривенного и интраамниальной маршруты инъекции в мышиных модели. Этот протокол может использоваться для внедрения клетки, вирусных векторов и других веществ в уникальной иммунной терпимо плода среду.

Abstract

В утробе матери трансплантации (ИТУ) — это уникальный и универсальный режим терапии, которые могут использоваться для введения стволовых клеток, вирусных векторов или любых других веществ в начале беременности. Обоснование ИТУ для терапевтических целей основывается на небольшой размер плода, иммунологические незрелость плода, доступности и пролиферативной характер фетальных стволовых и прогениторных клеток и потенциал для лечения болезни или появления симптомов до рождения. Принимая преимущества этих обычных свойств развития плода, доставки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) через ИТУ имеет потенциал для лечения врожденной гематологических расстройств, таких как серповидно-клеточной анемией, без необходимости myeloablative или иммуносупрессивные принадлежности, необходимые для послеродового HSC трансплантации. Кроме того доступность прогениторных клеток в нескольких органах во время разработки потенциально позволяет для более эффективной ориентации стволовых/прогениторных клеток после ИТУ вирусных векторов для генной терапии или изменения генома. Кроме того ИТУ может использоваться для изучения нормальных процессов развития, в том числе, но не ограничиваясь, развития иммунологической толерантности. Мышиных модель обеспечивает ценные и доступные средства для понимания потенциал и ограничения ИТУ до доклинические исследования на крупных животных и последующего клинического применения. Здесь мы описываем протокол для выполнения ИТУ в мышиных плода посредством внутривенного и интраамниальной маршрутов. Этот протокол успешно использовался для выяснения необходимые условия и механизмы, лежащие в утробе матери трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, индукции толерантности и в утробе матери генной терапии.

Introduction

Последние достижения в пренатальный скрининг и диагностика высветили возможность лечения плода для ряда врожденных расстройств, которые не имеют надлежащего послеродового лечения и приводят к значительным заболеваемости и смертности. В частности в утробе матери трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (IUHCT) и генной терапии/генома редактирования имеют потенциал воспользоваться нормального развития свойств плода для лечения врожденной, гематологические, иммунной и генетических расстройства более эффективно, чем послеродовой трансплантации ГСК и генной терапии/генома редактирования можно сделать1,2. В частности из-за небольшого размера плода, доноров клеток или вирусный вектор доза может быть максимально повышена весу получателя. Кроме того иммунологические незрелость плода позволяет доноров СКК для инъекций без myeloablative и иммуносупрессивные кондиционирования, что требуется в послеродовой трансплантации протоколы. Аналогичным образом вирусных векторов, перевозящих терапевтических трансген или редактирования технологии генома могут быть введены без ограничения иммунного ответа трансген продукта или вирусный вектор. Наконец доступность и пролиферативной характер плода стволовых/прогениторных клеток дают возможность более эффективно трансдукции прогениторных клеток-мишеней, а также определенных видов генома редактирования (ориентированные на гомологии ремонта), которые требуют Велоспорт клетки происходят эффективно. Мышиных модель служит глубокий и доступным средством для решения важных вопросов в клеточной биологии и иммунологии до экспериментировать в доклинических моделях крупных животных и, таким образом, служил в качестве основной модели в которых IUHCT и в матке терапия гена были изучены1,2,3.

Хотя многие переменные играют важную роль в успехе IUHCT и в утробе матери генной терапии/генома редактирования в мышиных и крупных животных моделях, ключевой переменной является метод доставки СКК или вирусный вектор. Доставка больших доз донорских СКК с эффектом первого прохода, происходящих в фетальной печени, гемопоэтических органа во время IUHCT, было показано, быть важную роль в достижении уровня macrochimeric приживления в мышь и большие животные модели4 ,5. Это было достигнуто посредством инъекции доноров клеток через vitelline вен в модель мыши и через укол внутри сердца в собачьей модели. Маршрут впрыска также играет основополагающую роль в ориентации прогениторных клеток различных органов во время разработки. Например внутривенные инъекции через vitelline вен доказано эффективно передают кардиомиоцитов и гепатоцитов после поздней беременности инъекции6,7. Кроме того инъекция интраамниальной вирусных векторов позволяет ориентации органов, которые физически подвергаются во время инъекции8на основе эмбриональных складные/развития. Наилучшим примером является ориентация эпителия дыхательных через инъекцию интраамниальной в конце беременности воспользоваться нормальной движений плода «дышать», который предоставляет дыхательных путей в вирусный вектор в амниотической жидкости9. Эти два режима ИТУ, внутривенно через vitelline вен и интраамниальной, были основой для нескольких прошлых и нынешних экспериментов в нашей лаборатории. В этом протоколе мы подробно описать методы для выполнения внутривенного и интраамниальной ИТУ в мышиных модели.

Protocol

Экспериментальные протоколы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в детской больнице Филадельфии. 1. Создание инъекции пипетки С помощью вертикальной микропипеткой съемник, вытащите 100 мкл микрокапиллярной пипетки (<strong class="x…

Representative Results

Выживание и приживления являются важными мерами успеха для IUHCT экспериментов. В зависимости от конкретных конечных точек эксперимента плодов, которые получил IUHCT может быть проанализированы пренатально путем кесарева сечения или постнатально. В среднем показатели в?…

Discussion

В утробе матери трансплантации является потенциальной терапии для многих врожденных расстройств, которые могут быть диагностированы в начале беременности. Мышиных модель ИТУ позволяет исследователям изучить плода окружающей среды или экспериментировать с различных видов тера?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Materials

Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

Referenzen

  1. Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
  2. Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
  3. Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
  4. Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
  5. Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
  6. Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
  7. Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
  8. Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
  9. Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
  10. Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
  11. Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
  12. Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
  13. Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
  14. Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
  15. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
  16. Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

View Video