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Umwelt

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Published: July 24, 2018
doi:
10.3791/57932
, , , ,
1Department of Agronomy and Horticulture and Center for Plant Science Innovation,University of Nebraska-Lincoln, 2USDA-ARS, Wheat, Sorghum and Forage Research Unit,University of Nebraska-Lincoln East Campus

Summary

Excavación de raíces de las plantas del campo, así como procesamiento de muestras en endosphere, rizosfera y suelo se describen en detalle, incluyendo métodos de análisis de datos y extracción de ADN. Este documento está diseñado para permitir a otros laboratorios a utilizar estas técnicas para el estudio del suelo, endosphere y microbiomes de la rizosfera.

Abstract

Estudios de planta y suelo microbioma se están volviendo cada vez más importantes para comprender que los microorganismos papeles juegan en la productividad agrícola. El objetivo de este manuscrito es proporcionar detalles sobre cómo rápidamente el suelo, rizosfera y endosphere de los ensayos de campo replicados de la muestra y analizar los cambios que pueden ocurrir en las comunidades microbianas debido al tipo de muestra, tratamiento y genotipo de la planta. El experimento utilizado para demostrar estos métodos consiste en parcelas de campo replicado que contiene dos, puro, pastos de estación cálida (Panicum virgatum y Andropogon gerardii) y una mezcla de pasto de baja diversidad (a. gerardii, Sorghastrum nutans, y Bouteloua curtipendula). Brevemente, las plantas son excavadas, una variedad de raíces se cortan y colocan en tampón fosfato y a continuación a agitar para recoger la rizosfera. Las raíces son llevadas al laboratorio en hielo y superficie esterilizado con lejía y el etanol (EtOH). La rizosfera es filtrada y concentrada por centrifugación. Suelo excavado de alrededor de la bola de la raíz se coloca en bolsas de plástico y trajo al laboratorio donde se toma una pequeña cantidad de suelo para las extracciones de ADN. ADN es extraído de las raíces, el suelo y la rizosfera y luego amplificado con cebadores para la región V4 del gene del rRNA 16S. Amplicones son ordenados y analizados con herramientas bioinformáticas de acceso abierto. Estos métodos permiten a los investigadores probar cómo la diversidad de la comunidad microbiana y composición varía debido al tipo de muestra, tratamiento y genotipo de la planta. Utilizando estos métodos y modelos estadísticos, los resultados representativos demuestran que existen diferencias significativas en las comunidades microbianas de suelo, raíces y rizosfera. Métodos presentados aquí ofrecen un conjunto completo de pasos de cómo recoger las muestras de campo, aislar, extraer, cuantificar, amplificar y la secuencia de ADN y analizan la diversidad de la comunidad microbiana y composición en ensayos de campo replicados.

Introduction

Microbioma investigación tiene implicaciones importantes para entender y manipular procesos del ecosistema como nutrientes bicicleta, volumen de materia orgánica y el desarrollo o inhibición de patógenos de suelo1,2. Esta área de investigación tiene también gran potencial para la comprensión de los impactos de los microbios del suelo en la productividad de las comunidades vegetales naturales y agroecosistemas. Si bien hay muchos estudios que se han centrado en el microbioma del suelo en ecosistemas naturales, pocos se han centrado en microbios de la rizosfera y endosphere de la planta en agroecosistemas3. En Nebraska, la agricultura domina el paisaje en gran parte del estado, haciendo los estudios de estos suelos donde agrícola importante cultivos un tema vital para la investigación. El objetivo de este trabajo de métodos es proporcionar a los investigadores un conjunto estándar de protocolos para describir los microbios presentes en los agroecosistemas, para determinar cómo las raíces de plantas modificar las comunidades microbianas en la rizosfera y endosphere y finalmente entender las funciones de que estos microbios juegan en productividad de planta y salud del suelo.

El método presentado aquí difiere ligeramente de los métodos utilizados por otros4,5 en que este documento está dirigido a aprender qué microbios son exclusivamente dentro de la raíz y cómo difieren de los microbios inmediatamente fuera de la raíz en el rizosfera. La secuenciación del amplicón utilizada en este estudio identifica los taxones microbianos encontrados en la muestra de ADN y permite a los investigadores a determinar cómo las comunidades cambian dependiendo del tipo de muestra o tratamiento. Una de las principales diferencias entre este protocolo y un protocolo muy similar utilizada por Lundberg et al. 6 es que en vez de sonicación, este protocolo utiliza esterilización superficial con lejía y el etanol para extraer la rizosfera de las raíces. Otros también han utilizado esterilización superficial efectiva7,8,9,10. Estos métodos no son más ventajosos que otros métodos, pero un poco diferente. Estos métodos son particularmente bien adaptados para los experimentos de campo grande ya con bastante gente que es posible procesar más de 150 parcelas de campo por día, que agrega hasta aproximadamente 450 muestras cuando dividida en endosphere, rizosfera y suelo. Este manuscrito describe en detalle los métodos utilizados para la muestra en el campo, procesar el material en el laboratorio, extraer y secuenciar el ADN y ofrece una breve descripción de los pasos para analizar los datos resultantes de la secuencia.

Protocol

1. el campo Descripción del sitio Describir sitios experimentales durante los períodos de colección. Determinar la ubicación del campo (latitud, longitud y altitud) utilizando un GPS. Describir la profundidad de muestreo, tiempo de muestreo y la textura del suelo. Factores ambientales desempeñan papeles importantes en la conformación de las comunidades microbianas. Registrar información de clima como la temperatura media anual, precipitación anual, la rotación de cultivos de años anteriores, las prácticas de labranza, método de fertilización y la historia del sitio de campo. Estaciones meteorológicas automáticas y otros dispositivos son útiles para registrar la temperatura y precipitación diaria en una estación de crecimiento. 2. recolección y procesamiento de muestras de suelo, rizósfera y raíz campo Excavación de las plantas. Etiquetar un recipiente de lavado y un balde con una nota adhesiva que contiene información sobre el material vegetal a ser muestreado. Incluir información como el número de parcela, genotipo de la planta y especies vegetales. Llevar el cubo etiquetado a la parcela y dejar la olla de colada en la estación de trabajo establecida en el campo. Perforar el suelo con una pala a una profundidad de 30 cm para cortar cualquiera de las raíces laterales manteniendo la planta en el suelo. El volumen aproximado es de 18 cm3. Al azar escoger y recoger dos plantas por parcela de diferentes áreas dentro de la trama. Excavar las raíces de la planta aprovechando la pala y colocar el cepellón en el cubo de etiquetado. Devuelva el cubo etiquetado con el cepellón excavada a la estación de trabajo en el campo. Corte y deseche la biomasa aérea de la planta. Remoción de suelo de las raíces y la colección de suelo a granel. Sacudir las raíces para quitar la suciedad manualmente o usar una pala o una excavadora manual para quitar la suciedad de las raíces. Sacudiendo las raíces es suficiente para quitar la suciedad en suelos muy arenosos. Utilice guantes y colocar las raíces cerca de la estación de procesamiento. Después de sacudir las raíces, la mayor parte del suelo estará en la bandeja de lavado. Mezclar el suelo en el recipiente de lavado y romper cualquier terrones con una sierpe de la mano. Coloque una muestra de suelo que esté libre de escombros en un etiquetado, bolsa cremallera 17,7 x 19.5 cm y en un lugar fresco o en hielo. Colección de raíces y rizosfera. Con unas tijeras de poda esterilizadas en el 70% EtOH, suprimir una variedad de raíces, de aproximadamente 4 a 6 raíces por planta y cada raíz alrededor de 9-12 cm de longitud. Colocar las raíces suprimidas (corte según sea necesario para caber) en un tubo etiquetado 50 mL que contenga 35 mL de tampón fosfato con autoclave, (6,33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L de Na2HPO4 anhidro, pH = 6,5, 200 surfactante μl/L).Nota: El surfactante (véase Tabla de materiales) fue agregado después de autoclavar el tampón fosfato. El volumen de la bola de raíz y longitud de la raíz varían dependiendo de la edad de la planta y especies vegetales. Agitar los tubos durante 2 min a la rizosfera de la superficie de las raíces. Con unas pinzas esterilizadas en el 70% EtOH, quitar las raíces del tubo, la mancha blanca /negra brevemente en toallas de papel y coloque en un nuevo etiquetado tubo 50 mL. Lugar tanto el tubo que contiene la rizosfera y la que contiene las raíces en el hielo. 3. proceso del campo de las muestras en el laboratorio Esterilización superficial de las raíces después de la recolección de campo.Nota: Realizar la esterilización superficial tan pronto como sea posible después de su regreso del campo. Si no es posible a la superficie esterilizar las raíces en el mismo día, almacenar raíces a 4 ° C hasta procesado. Añadir aproximadamente 35 mL de lejía de 50% + 0,01% Tween 20 para tubos de 50 mL de raíz recolectadas en campo. Agite los tubos 50 mL durante 30 a 60 segundos. Retirar el 50% de lejía y añadir 35 mL de 70% EtOH. Agitar durante 30 a 60 segundos. Retirar el 70% EtOH y añadir 35 mL de agua ultrapura estéril. Agitar durante 1 minuto. Repetir el lavado con agua dos veces más.Nota: Para asegurar que el tratamiento de esterilización superficial es suficiente, chapado en muestras de agua del último aclarado y no observado crecimiento de bacterias (Wang P., datos no publicados, 2014). Otros investigadores han probado para la eficacia de la esterilización de raíz con similares métodos9,10. La mancha blanca /negra seco de las raíces en toallas de papel limpias. Utilice una toalla de papel limpio para cada muestra.Nota: Toallas de papel pueden ser esterilizadas antes del uso. No esterilizar nuestras toallas de papel. Sin embargo, utilizamos 1 toalla de papel por ejemplo y mantener las toallas envueltas hasta. Utilizando pinzas estériles y tijeras de podar, cortadas las raíces en pedazos de 5 mm aproximadamente y el lugar corta las raíces en un tubo cónico de 15 mL limpio, rotulado. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta que la tramitación. Procesamiento de las muestras de la rizosfera. Agite los tubos de 50 mL que contiene muestras de la rizosfera del campo a suspender toda la muestra. Usando un filtro estéril, malla de 100 μm de la célula (véase Tabla de materiales), filtro la muestra resuspendida en un nuevo tubo de 50 mL. Centrifugar los tubos a 3000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Inmediatamente Quite y descarte el sobrenadante. Coloque bolitas de la rizosfera en los tubos de 50 mL en hielo. Añadir 1,5 mL de tampón de fosfato estéril (sin surfactante) a pellets de rizosfera y vortex para suspender. Pipeta el líquido suspendido en un tubo de microcentrífuga limpio, rotulado, 2 mL. Girar los tubos 15.871 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Inmediatamente Quite el sobrenadante y escurrir los tubos de toallas de papel limpias. Almacenar los pellets a-20 ° C hasta la tramitación.Nota: Pasos 3.2.2 – 3.2.4 se realizan para reducir el tamaño del tubo de muestra para el almacenaje. Es espacio más eficiente para almacenar los tubos 2 mL más pequeño en comparación con los tubos de 50 mL. Procesamiento de las muestras de suelo para análisis de suelo y extracción de la DNA. Con una espátula de metal estéril, llene un tubo de 2 mL limpio, rotulado con aproximadamente 3 g de suelo para la extracción de ADN. Evitar las piezas de raíz pequeña y escombros. Almacenar esta muestra de suelo a-20 ° C. La espátula de metal de enjuague en el 70% EtOH entre cada muestra. En una sartén limpia lavado, vacíe la bolsa de suelo en tamices apilados (véase Tabla de materiales), tamiz más grande en la parte superior del tamiz más pequeño y el tamiz manualmente el suelo a través de ambos tamices. Use un cepillo para limpiar los tamices entre muestras. Dejar de lado 100 a 125 g de suelo tamizado en una bolsa con cremallera de 17,7 x 19.5 cm para suelo futuro fisicoquímica y análisis de textura. Coloque las bolsas de suelo a 4 ° C para almacenamiento a corto plazo. Procesamiento de las muestras de suelo de la humedad del suelo. Tara una bolsa de papel marcada en una escala. Mide 40 a 45 g de suelo tamizado en la bolsa de papel marrón. Registrar el peso de la bolsa de papel marrón y el suelo en una hoja de datos y bolsas de lugar en un horno de secado en 55-60 ° C. Después de 72 horas, eliminar las bolsas de la estufa. Permitir que las bolsas de suelo enfriar durante al menos 30 minutos y luego pesar. Para registrar el peso, Tarar la balanza a cero y colocar las bolsas de papel marrón en la balanza. Calcular el porcentaje de humedad del suelo para cada muestra usando la fórmula:Nota: El método de humedad del suelo es de Kellogg biológico estación largo plazo investigación ecológica (LTER KBS). KBS LTER ofrece una amplia gama de protocolos establecidos para los investigadores en su página web (https://Lter.kbs.msu.edu/). 4. preparación de la raíz procesada de muestras para las extracciones de ADN. Moler el material de raíz congelado para que la muestra es homogénea. Verter el nitrógeno líquido en un vaso de plástico con espátulas limpias y en un mortero limpio para mantener muestras congeladas durante todo el proceso de molienda. Coloque el tejido congelado en el mortero y moler con el mortero en un polvo fino. Continuamente agregar nitrógeno líquido a través de pulido para mantener muestras congeladas. Use una espátula para colocar tejido de la planta en un tubo limpio y rotulado 2 mL. Tienda a-80 ° C. 5. extracción de ADN de muestras de suelo y rizosfera en formato de 96 pocillos Carga de muestras de suelo en placas de 96 pocillos. Limpie el área de trabajo con el 70% EtOH y el 1% de lejía. Guantes de laboratorio durante estos pasos. Retirar las muestras de suelo de almacenamiento-20 ° C y dejar para descongelar en un cubo de hielo. Saque el lacre mat de una placa de 96 pozos de extracción que se proporciona con el kit de extracción de ADN. Coloque la tapa selladora mate entre 2 Toallitas de papel para limpiar mientras no esté en uso. Para evitar la contaminación, utilice adhesivo PCR 8-bien las tiras para cubrir las 12 columnas de la placa de 96 pozos de extracción. Tarar un embudo estéril en forma de pesa (tamaño SM) en una escala y pesar 200 a 250 mg del suelo.Nota: Estos embudos estériles son aplanados por un lado, por lo que el embudo se pone plano a escala. El embudo se llena con tierra y colocado directamente en un pozo. Esta técnica evita la pérdida de muestras, minimiza los derrames y previene la contaminación cruzada. Para descubrir el primer pozo de la placa de extracción, con cuidado levante la cinta adhesiva, lugar el cuello del embudo de pesaje llenado en el bien y guie la muestra de suelo en el pozo correspondiente. Vuelva a colocar la cinta adhesiva para cubrir el pozo. Repita este proceso para cada pocillo de la placa, utilizando un embudo estéril nueva para cada muestra hasta llena la placa. Dejo uno bien vacía como un control en blanco de la extracción.Nota: Uno también se queda en blanco en cada placa de extracción para servir como un control negativo (blanco). Controla de contaminantes que pueden estar presentes en el kit de reactivos11. Sellado del mat en la placa de extracción y guardar la placa a-20 ° C hasta que esté listo para la extracción de ADN. Carga de muestras de la rizosfera en placas de 96 pocillos. Extraer las muestras de rizósfera de almacenamiento-20 ° C y deje que se descongele en un cubo de hielo. Siga los pasos para preparar la placa de extracción de ADN de 5.1.2. Coloque una toallita de papel limpia sobre una escala, luego una espátula de metal estéril en la escala de la vicia. Utilice la espátula para sacar cuidadosamente algunas de la pelotilla de la rizosfera de un tubo de muestra. Volver la espátula a la escala y pesan entre 200 y 250 mg de la muestra de la rizosfera. Levante con cuidado la cinta adhesiva para descubrir el primer pozo de la placa de extracción, ángulo de la espátula de llenada en el pozo y raspar el material de la rizosfera en el pozo correspondiente con un palillo estéril. Enjuague el espátula de metal en agua, seguido por el 70% EtOH entre muestras. Repita este proceso para cada pocillo de la placa hasta que la placa se llena, vaciar uno así como un control en blanco de la extracción. Extracción de ADN de muestras de suelo y rizosfera en formato de 96 pozos. Extracto de suelo y rizosfera ADN usando un juego optimizado para suelos (véase Tabla de materiales), siguiendo el protocolo del fabricante.Nota: Utilizamos este kit específico para aislar suelo y rizosfera ADN debido a la capacidad de los reactivos propiedad para eliminar el ácido húmico y otros potentes inhibidores PCR encontradas en el suelo. Cuantificación de ADN. Cuantificar las 92 muestras y 4 concentraciones de estándares utilizando un kit (véase Tabla de materiales; normas están incluidas), según protocolo del fabricante. Cuantificar las 4 muestras restantes que fueron removidas de la placa para pozos para los cuatro estándares usando un kit (véase Tabla de materiales), según protocolo del fabricante. 6. extracción de ADN de raíz las muestras en formato de 96 pozos. Carga de muestras de raíz en placas de 96 pocillos. Limpie el área de trabajo con el 70% EtOH y el 1% de lejía. Use guantes durante estos pasos. Mantener las muestras de raíz de tierra congeladas en todo momento colocando las muestras en un cubo con hielo seco. Llenar un vaso de plástico con nitrógeno líquido y microspatulas antiestático y embudos de pesaje estériles (tamaño XSM) en el vaso de precipitados de plástico se enfríe. Saque el lacre mat de la placa de grano de 96 pozos de extracción que se suministra con kit y colocar entre 2 Toallitas de papel para limpiar mientras no esté en uso.Nota: La versión más reciente de este kit, aparecido con posterioridad a la época que se realizaron las extracciones de ADN, requiere que el usuario suministrar las placas de extracción del grano. En la Tabla de materiales, hemos incluido la información de catálogo de proveedores necesaria para ordenar estos artículos. Para evitar la contaminación, utilice adhesivo PCR 8-bien las tiras para cubrir las 12 columnas de la placa de 96 pozos de extracción. Coloque la placa de bolas de extracción en hielo seco para mantener las muestras en los pozos congelados. Cuidadosamente levante la cinta adhesiva para descubrir el primer pozo de la placa de extracción, coloque el cuello del pesaje-embudo lleno en el pozo correspondiente y añadir 3 cucharones de espátula de tejido de raíz de planta. Vuelva a colocar la cinta adhesiva para cubrir el pozo.Nota: El suelo y la rizosfera son descongelados en el hielo antes del pesaje, considerando que el material vegetal es pesado congelado. Tejido de la planta congelado, especialmente pequeñas cantidades, es difícil de pesar en una escala sin descongelar. Peso se realizaron pruebas sobre tejido de raíz de suelo para determinar cuántas cucharadas de espátula eran suficientes. Tenga en cuenta que el fabricante del kit no requiere de una cantidad exacta de tejido pero recomienda alrededor de 50 mg. tipos de muestras diferentes puede variar y el usuario deberá determinar la cantidad apropiada. Repita este proceso para cada pocillo de la placa hasta que se llene la placa. Almacenar la placa a-20 ° C hasta que esté listo para la extracción de ADN. Extracción de ADN de tejido de raíz. Extracto de ADN usando un juego optimizado para plantas (véase Tabla de materiales) siguiendo el protocolo del fabricante.Nota: Utilizamos este juego que está diseñado específicamente para que el tejido de la planta lograr el máximo rendimiento de las muestras de raíz. A diferencia de suelos y rizosfera, el ácido húmico y otros contaminantes están a menos de un problema para el tejido de la raíz. Cuantificar el ADN como en el paso 5.4. 7. amplificación y secuenciación del ADN aislado. Amplificar la región V4 del gen 16S con una prueba de lectura de la polimerasa (véase Tabla de materiales) como se describe en Gohl et al. 12 muestras de código de barras con diferentes primers indexación y piscina antes de la secuencia. Secuencia utilizando los métodos descritos por Gohl et al12 utilizando un proceso de PCR de dos pasos con las cartillas de V4 (1 archivo suplementario).Nota: Algunos de los métodos para estos pasos se describen en detallan en otra parte12,13,14 y por lo tanto no se describen aquí. Para las muestras de raíz, bloqueadores PNA fueron agregados para reducir la cantidad de DNA del plastid amplificado desde el tejido vegetal, que previamente ha sido completamente descrito15. Dos controles fueron utilizados en la secuencia, un control negativo que incluía los extracción placa en blanco controles (ver nota después del paso 5.1.5), y una comunidad simulada de una población conocida de ADN bacteriano (véase Tabla de materiales) que sirvió como un positivo control.Nota: En la mayoría de los casos, la v3 de MiSeq Kits de reactivos se usan en el modo de final pares base 2 X 300. Para las muestras en este manuscrito, el Illumina HiSeq 2500 fue utilizado en modo rápido con 250 modo Paired-end (2 x 250). La muestra fueron ordenados en el mismo carril. Procesar los datos de la secuencia a través de una tubería para el análisis de la comunidad microbiana (v9.2.64 USEARCH, QIIME v1.9.1 y RStudio v3.4.3 16). Preparar los datos de secuenciación utilizando USEARCH17.Nota: USEARCH está disponible en línea con instrucciones completas (https://www.drive5.com/usearch/). Demultiplexar los datos de secuenciación utilizando el índice lee o Lee códigos de barras para asignar Illumina a muestras. Combinar la Lee final emparejados para obtener secuencias de consenso. Utilice el comando: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-relabel @ – fastq_maxdiffs 10 – fastq_minmergelen 230 – fastq_maxmergelen 320 – fastq_pctid 80 – fastqout merged.fq.Nota: Los parámetros se definen a través de referencia el manual de instrucciones USEARCH. Retire los iniciadores de los datos de la secuencia para evitar sustituciones en las secuencias de la cartilla, que pueden ser causadas por la reacción de PCR. Utilice el comando: usearch-fastx_truncate merge.fq – stripleft 19 – stripright 20 – fastqout stripped.fq. Filtrar datos de la secuencia para quitar la Lee de baja calidad y guardar secuencias de unidad taxonómica operacional (OTU) de alta calidad. Utilice el comando: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1.0 – fastaout filtered.fa. Generar OTUs en USEARCH. Realizar la especializada para identificar el conjunto de secuencias únicas del OTU. Utilice el comando: usearch-fastx_uniques filtered.fa – fastaout uniques.fa – sizeout-cambiarle Uniq. Se agrupan con semejanza de la secuencia de 97 – 100% para designar el únicos OTUs OTUs. Utilice el comando: usearch-cluster_otus uniques.fa – minsize 2 – otus otus.fa-cambiarle Otu.Nota: Este paso también incorpora la eliminación de los singletons de OTUs agrupados y el retiro de quimeras de los datos de la secuencia. Crear una tabla de la OTU en USEARCH. Utilice el comando: usearch-usearch_global stripped.fq – db otus.fa-filamento plus – id 0.97 – otutabout otutable.txt.Nota: Este comando genera una tabla con el número de lecturas (cuentas) de OTUs todas para cada muestra. La tabla OTU se utiliza para pasos posteriores incluyendo análisis de diversidad microbiana y análisis diferencial de la abundancia. Ejemplo de tabla OTU se muestra en la figura complementaria 2. Realizar un análisis de rarefacción en QIIME v1.9.1 18.Nota: La curva de rarefacción se calcula utilizando la tabla OTU para determinar si la profundidad de la secuencia correctamente muestras de la comunidad microbiana. Ejemplo de curvas de rarefacción se muestran en la figura 3 complementaria. Realizar un análisis de diversidad alfa18. Usar alpha_rarefaction.py en v1.9.1 QIIME para calcular la diversidad de la comunidad microbiana de cada muestra.Nota: Este análisis calcula índices de diversidad como Shannon19, Simpson20y Chao121. Llevar a cabo una beta diversidad análisis18,22. Utilizar el script de Python: beta_diversity_through_plots.py en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis de v1.9.1 QIIME.Nota: El presente análisis compara la composición de la comunidad microbiana entre las muestras. Llevar a cabo análisis estadísticos entre grupos. Utilizar las matrices de distancia calculadas para PERMONOVA utilizando la función de anova y adonis en el vegan paquete23 v2.4.5 RStudio16. Realizar el análisis canónico de análisis de coordenadas principales (CAP) utilizando la función capscale en el paquete vegan. Visualizar datos en ggplot2 paquete24 v2.2.1 RStudio.

Representative Results

Los resultados representativos presentados en este manuscrito proceden de un sitio de campo establecido en 2012 en la Universidad de Nebraska-Lincoln agricultura investigación división granja cerca de Mead, NE antes del experimento, el sitio había sido manejado como una rotación de maíz-soja . El sitio de estudio se encuentra en tres diferentes tipos de suelos, pero los datos se analizaron como si todos los cambios en las propiedades de suelo medidas fueron debido a los tratamientos impuestos. El sitio de campo contuvo dos, puro, soportes de switchgrass (libertad de cvp. virgatum ) y big bluestem (a. gerardii) así como una mezcla de hierba baja diversidad que contienen big bluestem, indiangrass (S. nutans) y ‘Butte’ pasto banderita ( B. curtipendula). Las tres parcelas de césped de temporada cálida fueron en un diseño de bloques completos al azar que se replicó tres veces. Anidado en las tres parcelas de hierba diferente eran dos tratamientos de fertilización de nitrógeno (N) que fueron 56 (N1) y 112 (N2) kg N ha-1 de urea aplicada. En el momento de muestreo del microbioma en el final de la temporada de cultivo, el suelo contenida 8.0 ± 1.1 (media ± SD) ppm nitrato en las parcelas fertilizadas con 112 kg de N ha-1 y 6,8 ± 0.7 (media + SD) nitratos ppm en las parcelas fertilizan con 56 kg N ha-1. Las parcelas habían sido fertilizadas una vez al año. El césped de estación cálida parcelas fueron señaladas como las parcelas principales (8000 m2) y tratamientos de N fueron las parcelas divididas (4000 m2). Bluestem grande fue sembrada como una mezcla de 50: 50 de ‘Bonanza’ y ‘mina ‘ de oro y tallo fue sembrado como una mezcla de 50: 50 de ‘Scout’ y ‘Warrior’. Las parcelas fueron plantadas en el 2012, y la primera aplicación de N se produjo en la primavera de 2013. El suelo y muestreo de raíz se realizó en 15 de septiembre de 2014. La obra que se describe a continuación se llevó a cabo en un campo que se estableció como un diseño al azar de parcelas divididas con tres repeticiones (figura 1). La profundidad promedio de la secuencia de todas las muestras de endosphere fueron los siguientes: 4871 ± 5711 (media ± SD), rizosfera: 40726 ± 14684, suelo: 38184 ± 9043. Una de las mayores fuentes de variación en estos experimentos, mediante los métodos descritos, es la diferencia en las comunidades microbianas que se encuentran entre los tipos de muestra (figura 2). En este conjunto de datos representativo, la rizósfera y suelo parecen ser más similares en composición entre sí que el endosphere (figura 2A). Sin embargo, hubo también altamente significativa (p = 0,001) diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre la rizósfera y suelo (figura 2B). La variación total en estos experimentos analizados por tipo de muestra fue de 26%. Análisis de la diversidad alfa demostró que las comunidades microbianas en la endosphere fueron menores en la diversidad de la muestra en comparación con el suelo y la rizosfera (figura 3). Las diferencias significativas sólo en la diversidad entre las especies de hierba en cualquier compartimiento fueron entre las muestras de endosphere de bluestem grande y switchgrass, con switchgrass tiene significativamente mayor diversidad de especies microbianas (figura 3). El análisis de abundancia relativa (figura 4) destaca el predominio de proteobacterias seguido de Actinobacteria en todos los tipos de muestra. Suelo y rizosfera están dominados también por Acidobacteria y Chloroflexi mientras que los endosphere tenía una mayor abundancia relativa de Bacteriodetes. En este experimento, las plantas fueron cultivadas con dos diferentes cantidades de fertilizante de N y por lo tanto, se analizaron los datos para determinar si existen efectos del tratamiento. Efectos del tratamiento representan 12% de la variación total pero no fueron significativamente diferentes, aunque en la ordenación los dos tratamientos parecen diferentes (figura 5). Esto pone de relieve la importancia de los análisis estadísticos de estos conjuntos de datos en lugar de inspección visual o los juicios cualitativos. Planta de influencia las diferencias en el microbioma de tejidos de la planta y del suelo fueron visualizadas usando un método limitado de ordenación. Las diferencias estadísticas se determinaron mediante un análisis PERMANOVA para comprobar variables específicas, tales como especie, como resultado en la composición de la comunidad microbiana significativamente diferentes entre las muestras. Cuando todos los tipos de muestra se analizaron juntos, se encontró una diferencia altamente significativa en la composición de la comunidad microbiana debido a especies de plantas (figura 6). En este experimento, la cantidad de variación por especies de plantas fue de 6.7%. Por último, cada tipo de muestra se analizó individualmente para determinar cuál de los tipos de muestra podría conducir el efecto de las especies de planta significativa. Sólo en el endosphere hubo una diferencia altamente significativa (p = 0.001) entre las composiciones de la comunidad microbiana de las diferentes especies de plantas (figura 7). En los otros tipos de muestra, el efecto de especies no fue significativo cuando se analizan individualmente. En el endosphere, la variación porcentual debido a la especie fue 27%, mientras que fue menor en la rizosfera (18%) y suelo (15%). Esto destaca más la importancia de analizar individualmente cada tipo de tejido. Figura 1: ejemplo del diseño de campo experimental. Diseño de campo experimental que ilustra un diseño de bloques completos al azar en triplicado del sitio campo ubicado en la Universidad de Nebraska-Lincoln del este Nebraska centro de investigación y extensión cerca de Mead, NE. Descripción del sitio completo consulte la sección de resultados. N1 es el bajo (56 kg N ha-1 urea) y N2 (112 kg de N ha-1 urea) es la tasa más alta de nitrógeno aplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Análisis de diversidad Beta que comparaban la composición microbiana en los tipos de diferentes de la muestra incluyendo endosphere, rizosfera y suelo de la toma de muestras de pastos perennes en el 2014. El análisis se realizó utilizando un script de Python en QIIME1.9.1 para producir la matriz de disimilitud de Bray-Curtis. Análisis de coordenadas principales (PCoA) basados en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis fue visualizado en RStudio. PCoA1 y PCoA2 indican la primera y segunda varianza explicada por el análisis de PCoA. Se realizó análisis estadístico PERMANOVA para determinar la significancia entre los tipos de muestra y el valor de p se muestra en la esquina superior derecha. Cada símbolo en las figuras representan a toda la comunidad microbiana de cada muestra. (A) tipos de muestras de suelo, rizosfera y Endosphere se analizaron juntos. Todas las 87 muestras fueron enrarecidas a 486 secuencias por muestra. (B) las muestras de rizósfera y suelo se analizaron juntos. Todas las 59 muestras fueron enrarecidas con 8231 secuencias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Análisis de diversidad alfa utilizando el índice de Shannon para cada especie en el endosphere, rizosfera y suelo. El análisis se realizó utilizando un script en Python en el QIIME1.9.1. Vacuo se hizo endosphere, rizosfera y tipos de muestras de suelo respectivamente con secuencias 486, 17154 y 8231 por muestra. Cajas indican los percentiles 25 y 75 (primeras y terceros cuartiles). La línea horizontal dentro de la caja indica la mediana y el rojo además muestra la media. Bigotes muestran el rango de los datos excluyendo valores extremos (que se muestran como puntos negros) que cayó más de 1.5 veces el rango intercuartílico (n = 6 para cada muestra excepto de pasto banderita mezcla donde n = 5). El índice de Shannon de las cinco especies en el endosphere fueron más bajas que la rizósfera y suelo. No paramétrica prueba de suma de rango de Wilcoxon fue utilizada para determinar la significancia entre las especies y sólo diferencias significativas entre especies fueron demostradas encima de las cajas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: abundancia relativa en el nivel de phylum en el suelo, endosphere y rizosfera. Las muestras fueron analizadas para comparar la abundancia de phyla microbiana entre los tipos de muestras diferentes (n = 29 para cada tipo de muestra). El análisis se realizó utilizando un script de Python en QIIME1.9.1 de la tabla de la OTU. Los distintos colores dentro del gráfico indican lo phyla. El porcentaje indica la abundancia relativa de cada phylum en cada tipo de muestra. La información de filo fue anotada con el proyecto de base de datos Ribosomal clasificador (RDP)25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: análisis con tratamiento como factor vinculante entre todos los tipos de muestra. Análisis canónico de análisis de coordenadas principales (CAP) fue realizado para determinar si existen diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre los tratamientos. Para cada tratamiento de N, n = 42 para N1 (56 kg N ha-1) y n = 45 para N2 (112 kg de N ha-1). La matriz de disimilitud de Bray-Curtis se generó usando un script en python en el QIIME1.9.1. Se realizó análisis de tapa basado en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis al limitar el tratamiento como el factor de RStudio. Se realizan análisis PERMANOVA para determinar si las diferencias de tratamiento fueron significativas, y el valor de p se muestra en la esquina superior derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: análisis utilizando especies de plantas como factor vinculante entre todos los tipos de muestra. Análisis se realizaron para determinar si existen diferencias en la composición de la comunidad microbiana entre especies vegetales en todos los tipos de muestra. Ordenación de coordenadas principales y el análisis de la tapa de todos los tipos de muestra (endosphere, rizosfera y suelo) se realizaron utilizando una matriz de disimilitud de Bray-Curtis. La matriz de disimilitud de Bray-Curtis fue generada usando el script de Python en QIIME1.9.1. Análisis de tapa basado en la matriz de disimilitud de Bray-Curtis fue hecho por restricción de las especies de plantas como el factor de RStudio. Se realizó análisis estadístico PERMANOVA para determinar la significancia entre especies de plantas, y el valor de P se muestra en la esquina superior derecha. Cada símbolo en las figuras representa a toda la comunidad microbiana para esa muestra. n = 18 para cada especie en todos los tipos de muestra excepto n = 15 para la mezcla de grama pasto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: ejemplo de análisis de PAC con especies como factor de restricción para cada tipo de muestra individualmente. Ordenación de coordenadas principales y el análisis de la tapa de cada tipo de muestra (endosphere, rizosfera y suelo) utilizando la matriz de disimilitud de Bray-Curtis. Cada tipo de muestra fue enrarecido a 486, 17154 y 8231 lecturas por muestra en endosphere, rizosfera y suelo respectivamente. Especies se utilizan como factor para restringir la ordenación. Se realizó análisis estadístico PERMANOVA para determinar la significancia entre especies de plantas en cada tipo de muestra y el valor de p se muestra en la esquina superior derecha. Cada símbolo en la figura representa a toda la comunidad microbiana de cada muestra. Tamaño de la muestra es n = 29 para cada tipo de muestra, n = 6 para cada especie de planta en cada tipo de muestra, excepto para la mezcla de grama de pasto (n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los métodos descritos en este manuscrito deberían permitir a los científicos entrar fácilmente en el campo de la metagenómica de suelo y planta. Con los años, hemos refinado nuestros métodos desde realizar el experimento descrito en este manuscrito. Un cambio es que ahora la etiquetamos los tubos antes de salir al campo a la muestra. Nuestro laboratorio utiliza un sistema de código de barras y una impresora de etiquetas. La impresora no sólo ahorra tiempo cuando etiquetado tubos, pero también lo hace todo más fácil para seguir y para identificar correctamente las muestras sin los caprichos de la escritura de la mano humana. Otro punto crítico es que tratamos de procesar el material después de traerlo detrás del campo tan pronto como sea posible. Nuestro objetivo es congelar el suelo utilizado para el análisis de ADN, esterilizar y congelar las raíces y filtrar y congelar la rizosfera dentro de 12 a 36 horas después de regresar del campo. Los procedimientos de extracción de ADN son largos con muchos pasos, sobre todo de suelos y rizosfera, así que hemos comprado un robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) que minimiza las manos a tiempo para los protocolos de extracción de ADN, reduce los errores humanos que pueden ser introducidos, y mejora la consistencia en la manera diferente se procesan lotes de tierra, raíces o rizosfera. Cuando se trabaja con material vegetal es importante decidir el tipo de raíz a estudiar o a tomar una variedad de tipos de raíz para obtener una “muestra representativa”. Mantener las raíces y deja en un estado congelado cuando realizar las extracciones de ADN es importante, como es garantizar no hay ninguna contaminación cruzada entre muestras al llenar placas de extracción de ADN de 96 pocillos. Otro factor importante a considerar es el número de repeticiones cuando diseñar experimentos de campo y utilizando una completa al azar diseño en lo posible26. Debido a la variabilidad del campo alto puede ser necesario disponer de un gran número de repeticiones para detectar pequeñas diferencias. Finalmente, desde nuestra experiencia es esencial para asegurarse de que los suelos no son demasiado mojados cuando excavando las raíces. Si los suelos están saturados con agua no sólo es sucio trabajar con, pero también es muy difícil definir la rizosfera y a quitar el suelo de las raíces.

Una modificación que se hizo durante el desarrollo de estos métodos fue en lugar de agitación de los tubos con la mano para soltar la rizosfera que aumentamos a vortexers alimentado por un generador de gas para facilitar el trabajo en el campo y más estandarizada en términos de el tiempo y forma que cada tubo se agitó. Una limitación del enfoque de secuenciación de amplicones es que la resolución taxonómica de los resultados a menudo es limitada y muchos OTUs conocido desconocido o solamente a nivel de familia o género. Este campo de la investigación está evolucionando rápidamente por lo que es importante ser consciente de los enfoques nuevos y en desarrollo, particularmente para el análisis de datos que puede aumentar la resolución de los resultados.

Estos protocolos son sólo para el estudio de las bacterias y arqueas, no hongos. Se permitirá el uso de diferentes primers para la amplificación para el estudio de las comunidades fúngicas utilizando el mismo DNA muestras27,28. Estos métodos no requieren la compra de grandes cantidades de equipo ya que pueden simplificar los métodos. Los métodos que Describimos aquí son principalmente para determinar “quién está allí”, pero el campo está evolucionando rápidamente a importantes preguntas sobre la función, que puede resolverse usando métodos de secuenciación de escopeta, aislamiento y pruebas de la funcionalidad de microbios, o genomas microbianos todo la secuencia.

Los resultados representativos destacan las diferencias en las comunidades microbianas que pueden ser identificadas usando los métodos descritos. Usando un enfoque de diversidad beta para el análisis de datos22, se demostraron diferencias compositivas entre tipos de muestras. Estas diferencias se han observado claramente en la mayoría de los otros estudios donde endosphere, rizosfera y suelo contienen comunidades microbiana3. Se calculó el índice de diversidad de Shannon para determinar la abundancia y la uniformidad de las especies microbianas presentes dentro de cada especie de planta en el suelo, endosphere y rizosfera. Como se muestra en este estudio y en muchos otros, la diversidad alfa es más alta en el suelo, disminuyendo ligeramente en la rizosfera y luego disminuyendo significativamente en el endosphere3,5,29. Estos resultados indican que los métodos aquí descritos son adecuados para la identificación de cambios composicionales en el endosphere, la rizósfera y suelo.

La dominación de las proteobacterias es el encontrar común en estudios de suelo y endosphere30,31,32. Endosphere tiene generalmente una baja diversidad de especies microbianas con una mayor abundancia relativa de las proteobacterias. Otra vez esto pone de relieve que los resultados aquí son representativos de otros hallazgos en la literatura. Los efectos del tratamiento en este estudio no fueron significativamente diferentes y dos razones principales para que pueden ser que no eran lo suficientemente grandes como para generar suficiente variación para detectar las diferencias impuestas por los tratamientos y que este muestreo se realizó al final de la temporada, cuando los campos puedan haber tenido tiempo suficiente para reducir el nitrógeno a niveles similares, que es lo que se midió en el final de la temporada de cultivo. En otro estudio utilizando tasas de fertilización similares durante un tiempo, relativamente pequeños cambios en la composición de la microbioma fueron medidos33. Otros estudios han mostrado cambios en las comunidades de hongos y bacterias debido al nitrógeno fertilizante34,35.

Especies de plantas se sabe que desempeñan un papel en la determinación de su microbiomes3,32,36 y aún pequeñas diferencias en la variación de la comunidad microbiana han sido demostradas entre genotipos de plantas dentro de un sola especie37. En este estudio, se encontró una diferencia significativa en la composición de la comunidad microbiana entre especies de plantas. En todos los tipos de muestra parece que switchgrass tenía la composición microbiana más diferenciada, pero las diferencias entre especies sólo fueron estadísticamente significativas en la endosphere. Composición de la comunidad de rizosfera puede se han convertido en importante si disponía de más repeticiones para el análisis.

Campo combinado, laboratorio los protocolos analíticos descritos aquí proporcionan un método poderoso para el estudio de cómo los diferentes factores influencia la composición de las comunidades microbianas de suelos y rizosfera la endosphere de raíces36. Hay una gran cantidad de trabajos a realizar en el área de estudio de microbiomes, particularmente en los campos agrícolas. Preguntas importantes acerca de cómo los rendimientos se ven alterados por el microbioma del suelo tienen que ser aclarado completamente. Incluso las preguntas más básicas sobre cómo rotaciones influyen en el microbioma de la tierra, cómo el tiempo altera el microbioma, estrés abiótico como altera el microbioma, tipo de suelo interactúa con estos factores para modificar el microbioma y si hay universales microbios en ciertos cultivos o regiones de los Estados Unidos son todas las cuestiones pendientes. Estos métodos también será útiles para estudios epidemiológicos identificar la presencia y persistencia de bacterias patógenas y beneficiosas. Otro horizonte futuro de estos métodos será iniciar la integración de los métodos de ADN descritos aquí con planta y microbio RNA y los datos del metabolito. Mejoría adicional y pruebas de variables será importantes para la mayor optimización de estos protocolos.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El desarrollo de este manuscrito es apoyado por el Centro Nacional de Ciencias Fundación EPSCoR de raíz y Rhizobiome innovación Premio OIA-1557417. La recolección de datos fue apoyada por fondos de la Universidad de Nebraska-Lincoln, investigación y desarrollo agrario y por una subvención de portilla de USDA. También reconocemos el apoyo de la USDA-ARS y fue apoyado por la agricultura y alimentos investigación iniciativa competitiva beca Nº 2011-68005-30411 del Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura para establecer y gestionar estos campos.

Materials

Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX – household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 – Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems
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Referenzen

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McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).
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