Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er en modell for å studere osmoregulation og antifouling. Imidlertid gir naturlige sesongmessige gyting en uforutsigbar tilførsel av cyprid larver. Her, er en protokoll for alle året rundt dyrking av B. improvisus beskrevet, inkludert produksjon av larver. Bruk av kultivert barnacles i gene expression studier er illustrert.
Barnacles er marine krepsdyr med et fastsittende voksen og frittlevende, planktoniske larver. Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er særlig relevant som modell for studiene i osmoregulatory mekanismer på grunn av sin ekstreme toleranse for lav saltholdighet. Det er også mye brukt som modell for å bosette biologi, spesielt i forhold til antifouling forskning. Imidlertid gir naturlige sesongmessige gyting en uforutsigbar tilførsel av cyprid larver for studier. En protokoll for alle året rundt dyrking av B. improvisus er utviklet og en detaljert beskrivelse av alle trinnene i produksjonslinjen markeres (dvs., etablering av voksen kulturer på paneler, samlingen og stell av Barnacle larver, og administrasjonen av mate for voksne og larver). Beskrivelsen også gir veiledning om feilsøking og diskuterer kritiske parametere (f.eks, fjerning av forurensning, produksjon av høy-kvalitet mate, bemanning for og betydningen av høy kvalitet sjøvann). Hvert parti fra culturing systemet maksimalt gir omtrent 12.000 nauplii og kan levere fire bunker i en uke, så opp til nesten 50.000 Larvene per uke kan produseres. Metoden som brukes til kultur B. improvisus er sannsynligvis, i stor grad gjelder også for andre marine dyr med gratis-swimminglarvae. Protokoller er presentert for Disseksjon av ulike vev fra voksne samt produksjon av høy kvalitet for studier av genuttrykk. Det er også beskrevet hvordan kulturperler voksne og reared cyprids kan benyttes i en rekke eksperimentelle design for å undersøke genuttrykk i forhold til eksterne faktorer. Bruk av kultivert barnacles i genuttrykk er illustrert med studier av mulig osmoregulatory roller av Na+/K+ ATPase og aquaporins.
Barnacles er marine krepsdyr med et fastsittende voksen og frittlevende, planktoniske larver. De fleste 1.200 arter med rur bor grunt vann, og mange er ofte utsatt for lav saltholdighet. Én art, bay barnacle Balanus (Amphibalanus) improvises (B. improvisus), kan tåle nesten ferskvann og Charles Darwin beskrevet denne arten fra en liten bekk i elvemunning av Rio de la Plata i Uruguay1. Ekstreme toleranse tolow saltholdighet gjør B. improvisus spesielt relevant modell for studiene osmoregulatory mekanismer2,3. Denne barnacle foretrekker brakkvann forhold, men kan leve i vann med salinitet fra rundt 1,6 psu til så høyt som 40 psu4. Det er den eneste barnacle arten finnes i brakkvann Østersjøen. B. improvisus antas å stamme fra østkysten av det amerikanske kontinentet, men i dag er funnet over hele verden på grunn av spredning av shipping5. Det er en stor begroing organisme er vanligvis funnet på steiner, brygger og båtskrog og er derfor av generell interesse for å forstå mekanismene av biofouling på konstruksjoner i marint og brackish vann6,7.
I likhet med de fleste andre RUR, B. improvisus er hermafroditter med cross-fertilization; reproduksjon oppstår gjennom parring mellom nærliggende personer som bruker en langstrakt penis og indre befruktning. Reproduktive perioden er hovedsakelig fra mai til September. B. improvisus har syv pelagisk larver stadier (seks nauplii etterfulgt av en cyprid trinn8). Befruktede egg lukene i en nauplius Larven som frittlevende og feeder i kolonnen vann for opptil flere uker før molting i en ikke-fôring cyprid larve. Cyprid bruker flere signaler til å finne et egnet sted å bosette seg og deretter gjennomgår metamorfose i fastsittende juvenile barnacle9. Arten kan være kulturperler i laboratoriet og har en levetid på 1-2 år i havet (2-3 år i laboratory kultur). Gjennomsnittlig B. improvisus vokser til 10 mm diameter (med maksimalt rundt 20 mm), og når en maksimal høyde ca 6 mm (selv om det kan bli høyere under overfylt forhold). Arten kan bli identifisert av sin glatt kalkholdig selv shell (hvit eller grå), radiellt mønstret kalkholdig base av shell plate, og formen på tergal plater1,10.
Barnacle B. improvisus har flere fordel funksjoner som en modell for studier av osmoregulation, med fokus på molekylære og fysiologiske mekanismene som økologiske interaksjoner og evolusjonære konsekvenser. Det er også mye brukt som modell for undersøkelser for å bosette biologi, spesielt i forhold til antifouling forskning og mekanismer involvert7,11,12,13. Imidlertid gir naturlige sesongmessige gyting en uforutsigbar tilførsel av cyprid larver for studier. Muligheten til å kultur denne barnacle gjennom livssyklusen hele året er derfor et stort aktivum aktivere ulike typer molekylære og mekanistisk studier. I tillegg gir sin tilstedeværelse i marine/brakkvann verdensomspennende en kombinasjon av felt og eksperimentelle studier. Kontrollert avl kan også produsere familier av kjente stamtavler for langsiktig dyrking14, og gangen generasjon av noen få måneder kan langsiktige eksperimentelle utviklingen. Det finnes også et utkast genom og flere transcriptomes, og disse ressursene er brukt for kloning av flere gener (f.eks, gener av betydning i osmoregulation)2,3.
Målet med denne protokollen er å beskrive hvordan å etablere og opprettholde en kultur for barnacle B. improvisus hele året for å utføre gene expression studier på voksne eller larver av denne organismen. Rittschof et al. 15 kort beskrevet en metode for dyrking barnacles fra utgivelsen av nauplii til oppgjør av cyprids for arten Balanus amphitrite. Protokollen er tilpasset alle året dyrking av B. improvisus på Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige), og en detaljert beskrivelse av alle trinnene i produksjonslinjen markeres, inkludert produksjon og stell av barnacle Larvene, i tillegg til administrasjonen av mate for voksne og larver. En oversikt over den komplette prosedyren, se figur 1. Bruk av culturing systemet er eksemplifisert med noen vanlige eksperimentelle oppsetninger og illustrert i funksjonell genomforskning studier av Na+/K+ ATPase og aquaporins, Klargjørende deres mulige funksjoner i osmoregulation2, 3. Det er noen ganger nødvendig å undersøke genuttrykk bestemt vev, og noen av grunnleggende barnacle disseksjon vil bli dekket. Med god tilførsel av høy kvalitet sjøvann, bør dyrking av barnacle B. improvisusog potensielt mange andre arter, være mulig i marine laboratorier over hele verden.
Barnacle kultur på Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige) har kjørt over 20 år og har vært brukt i studier i mange forskjellige forskningsområder. Over 30 vitenskapelige artikler har blitt publisert som har benyttet culturing systemet under de siste årene, inkludert studier i antifouling13,22, hydrodynamikk23, kjemiske økologi24, klimaendringer16 , evolusjonsbiologi5og molekylærbiologi2.
For å unngå valg av visse personer som er mer tilpasset laboratoriemiljø (personer som ikke er representative for befolkningen ville), anbefales det å samle en ny stamfisk fra feltet hvert år. Dessuten, er det også lurt å forynge kulturen årlig, siden det er omtrent 50-80% av dødelighet hos voksne under et normalår. Hvis målet er å produsere innavlet linjer eller definere studier av eksperimentelle evolusjon, er det imidlertid bare laboratorium-bakside familier skal brukes.
En god tid å samle B. improvisus på panelene Tjärnö Marine forskningslaboratoriet er i juni-August fordi på den tiden, det er en god tilførsel av cyprid larver i havet. Sjekk panelene ukentlig se når barnacle bosetningen starter og manuelt fjerne andre avgjort arter enn B. improvisus (f.eks, blåskjell, kappedyr, bryozoans, hydroids, nemerteans/tubeworms og andre barnacle arter) fra den paneler (f.eksmed en tannbørste). Rundt Tjärnö er det tre grunt vann barnacle arter til stede (B. improvisus, Semibalanus balanoidesog Balanus crenatus). B. improvisus er imidlertid dominerende fouler glatt harde flater i juli-August. S. balanoides har sin utligningsperioden begynnelsen våren og foretrekker hovedsakelig naturlige underlag (f.eks, steiner). B. crenatus kan forekomme på lave tall på panelene i løpet av sommeren.
Det er også mulig å starte nye voksen barnacle generasjoner kulturperler cyprids, som ville være nødvendig hvis visse linages med spesifikke egenskaper er etablert, eller i studier av eksperimentelle evolusjon. Den mest praktiske måten å starte nye generasjoner av voksne er å bosette cyprids på termoplastisk paneler i laboratoriet. Disse panelene med nylig utlignet cyprids kan også brukes i eksperimentell behandlinger eller eksponering i feltet. I nødsituasjoner kan man også bruke voksne på blokker fra et nærliggende område (f.eksIdefjorden ved Tjärnö Marine Research Laboratory) der B. improvisus er vanlig. Disse allerede etablerte voksne er behandlet på samme måte som voksne på panelene, dermed blir plassert i skuffer og matet via gjennomflytsenhet systemet. Flyt celler kan også brukes til å opprette paneler med rur25. Dette er gjennomflytsenhet kamre med plankton netto på sidene som cyprids ikke slå, med paneler som eneste for larvene.
Det er flere trinn som er kritiske for å sette opp en langsiktig fungerende barnacle kultur inkludert alle livsstadier. Metodene som brukes til kultur B. improvisus er sannsynligvis, i stor grad, gjelder også for andre marine dyr med frittlevende, planktotrophic larver. Dyrking prosedyrer for noen arter er allerede godt beskrevet (f.eksfor blå blåskjell og ulike arter av østers)26, mens for andre marine dyr, det er bare noen eksempler på langsiktige kulturer som spenner over hele livet syklus. En av de første vellykkede forsøkene på å kultur rur (B. amphitrite) ble gjort av Rittschof et al. 15. langsiktige økonomiske og personlige ressurser bør være på plass før du vurderer å sette opp en barnacle dyrking anlegget. Vedlikehold av denne typen året-rundt barnacle kultur krever minst én person arbeider halv tid. Det kan være noen potensielle fremtidige automatisering av noen trinn i produksjonslinjen, hovedsakelig dyrking av mikroalger27. I tillegg for å lykkes, er det viktig å ha tilgang til store mengder av høy kvalitet sjøvann. Dyrking av mikroalger, Artemia, og barnacles innebærer ikke noen bestemt sikkerhetsrutiner. Men må tester av noen antifouling stoffer eller giftige kjemikalier forsiktighetsregler.
Panelene ble sjekket flere ganger i uken for forurensing. Sjøvannet i kulturen ble pumpet fra 40 m dyp i Kosterfjorden utenfor Tjärnö Marine Research Laboratory og gikk gjennom to sand filtre før lab vannsystemet. Hvis ingen filtrering av vannet hadde blitt gjort, ville det være mye mer forurensning i kulturen. Det er viktig å regelmessig vaske panelene i kulturen fra detritus og andre dyr (f.eksstolon-bygningen hydroids og ROV nemerteans) angir systemet gjennom tilførsel av sjøvann fra feltet. For eksempel hvis ingen Larvene produseres til tross for at kultur har vært velfødde og ellers synes å være i god stand, problemet skyldes tilstedeværelse av nemerteans som synes å hemme parring. Naturligvis, mange av de skadelige organismene i kulturen på Tjärnö Marine forskningslaboratoriet var spesifikke for Sveriges vestkyst, og andre typer forurensende organismer vil være utbredt og være mer av en utfordring i andre geografiske områder. På vestkysten av Sverige er det uvanlig å finne forurensning av andre barnacle arter på panelene. Noen ganger, etablering av S. balanoides har blitt funnet, men dette er et marginale problem (mest, en S. balanoides miljøgifter for 10.000 B. improvisus prøver). Mangel på forurensende arter var sannsynligvis avhengig regimet å etablere nye kulturer om sommeren når larvaefrom B. improvisus var svært dominerende. I tillegg var det også en klar anriking av B. improvisus på panelene siden denne arten er selektiv for glatte flater13.
Det er viktig å fjerne død voksen RUR. Hvis de tomme skallene igjen på panelene, kan de bli en ly både for Artemia nauplii og ulike forurensende arter. I tillegg har det blitt konstatert at døde individer innflytelse trivsel i nabolandet individer, sannsynligvis med utgivelsen av giftige stoffer i nedbryting. En ytterligere konsekvens av voksen dødelighet er at noen personer vil stå alene og for langt fra noen andre voksne tillate mating (selv om barnacles har lengste penis i dyr verden i forhold til størrelsen)28. Disse personene vil overleve, men er ikke-produktive for larver. Men disse ensomme voksne individer kan forsiktig fjernes uten å skade base-platen og plasseres horisontalt nær andre aktivere parring. Barnacles kan også bli parret ved å plassere paneler med en voksen på hver, men nært nok slik at cross-fertilization kan oppstå. På denne måten kan genetisk linjer være produsert14.
Det er viktig å produsere en innmating av høy kvalitet og å mate kulturer nesten hver dag. Et par dager uten mat kan resultere i en mindre versjon av larver. Tidligere tester av kosthold sammensetning har vist at Kiselalger er avgjørende for vekst og overlevelse av barnacle nauplii. Flere slektene arter synes tilstrekkelig som fôr, selv om små eller enslig celler (mindre enn 10 µm i diameter) kan være nødvendig for de nauplii inntak. Arten S. marinoiog C. simplex T. pseudonana har alle vist seg for å være tilstrekkelig feed for B. improvisus nauplii, og lett å dyrke. I tillegg er feed kvaliteten generelt høyere for eksponensielt voksende alger. Det er også rapportert at Kiselalger er avgjørende for å etablere produktiv kulturer B. amphitrite15. En teori om viktigheten av Kiselalger er at de har en unik fatty acid-profil og er spesielt rik på svært flerumettet 20:5 fettsyrer29. Det har vist at visse fettsyrer er viktige for den vellykkede utviklingen av østers Larvene30.
Gjennom årene har det vært ingen forekomst av ødeleggende sykdommer i barnacle kultur. I mange kommersielle virvelløse aquacultures, som østers og muslinger, sykdommer er ganske vanlig og kan være svært skadelig. Skadelige effekter av virus har også blitt rapportert fra ville populasjoner. Native østers i Frankrike ble erstattet av portugisisk østers Crassostrea angulata i 1925, men denne arten ble utryddet av en iridovirus rundt 197031. Nylig har det vært massiv dødelighet hendelser i Pacific østers Crassostrea gigas i kulturer over hele verden, som synes å være forbundet med ostreid herpesvirus 132. Ingen rapporter om patogener, bakterier eller virus med rur har blitt publisert så langt. Men i pågående genom-prosjektet på B. improvisus, virus sekvenser ble funnet (Alm Rosenblad et al., upubliserte data) men med ingen åpenbar link til symptomer av sykdommer. Blandinger av antibiotika er tidligere brukt kulturer å minimere risikoen for bakterielle infeksjoner; denne fremgangsmåten er nå forlatt, og så langt har dette ikke ført forurensning problemer.
Hvis sjøvann varmes opp (som beskrevet ovenfor), kan overoppheting være den mest alvorlige risikoen i produksjonslinjen kultur. Det er selvfølgelig vanskelig å beskytte mot overoppheting, selv om sensorer og riktig varsling systemer kan være brukt (f.eks, sende e-post eller tekstmeldinger til ansvarlige personer). Hendelser av denne typen i siste har resultert i betydelige drap voksne i kulturen. Dette kan selvfølgelig være ødeleggende og ødelegge langsiktige investeringer av tid og penger. Spesielt vil dette være katastrofale hvis innavlet genetisk linjer er etablert. For å sikre lang av slike linjer og sikre dem mot utilsiktet tap, ville det være ønskelig å utvikle en kryonisk bevaring metodikk for RUR. Det har blitt rapportert at larvene fra Pacific østers kan være frosset ned og gjenopplivet med delvis suksess33. Cryobanking har også vært et verdifullt verktøy for å bevare de genetiske ressursene for en rekke arter34. Selv nauplii fra B. amphitrite rapporteres å overleve frysing35, og det ble funnet at 20% frosset ned personer ble forvandlet til cyprids36. Søknad fryser for den langsiktige bærekraften i kulturer har så langt ikke blitt adoptert, men dette vil faktisk være nødvendig for vedlikehold av valgte linjer; Dette vil være et viktig skritt å etablere fast B. improvisus i en potent marine modelsystem.
Her, ble en protokoll presentert for Disseksjon av ulike vev fra voksne av B. improvisus (dvs., cirri, soma og mantel). Det må imidlertid understrekes at andre vev kan også være hentet. For eksempel er bløtvev mellom ytre og indre mantelen av membranous-base arten Tetraclita japonica formosana nøye isolert og en RNA utvinning og RNA-seq analyse av gene expression37. Skissert optimalisert utvinning protokollen beskrevet her gir tilstrekkelige mengder av høy kvalitet for sekvenser fra en minimal mengde starter materiale. Først minimerer innsamling av personlige Larvene direkte inn i homogenisering rørene tap under overføringen fra en tube til en annen. Videre testet blant de forskjellige metodene, homogenisering med keramiske perler viste seg for å være den mest effektive i RNA gi og integritet, sammenlignet med sonication eller støter homogenisering. Når du planlegger genuttrykk eller genomics eksperimenter, må man huske på utfordringen med høy genetisk variasjon i RUR, minst for B. improvisus. Barnacle har en genetisk mangfold i området 3-5%, selv i koding regioner (Alm Rosenblad et al., upubliserte data). Dette, selvfølgelig, legger spesifikke krav på design av primer for qPCR analyse, der mer bevart områder bør identifiseres og brukes som maler for primere for å få konsekvent uttrykk resultatene betweenbatches. Konserverte områder for målet gener, som aquaporins og Na / K + ATPases, kan identifiseres ved å studere sekvens variasjon av disse genene i RNA-seq data fra populasjoner av cyprids som inneholder hundrevis av personer. For en genomet analyse, vil DNA prøves. Imidlertid kan få høykvalitets DNA fra B. improvisus være utfordrende21.
Avslutningsvis etablerte barnacle kulturen har vist seg for å være medvirkende i forskjellige eksperimentelle studier. Spesielt all-året-rundt larver produksjonen tillater oss å utføre eksperimenter uten tilværelse begrenset til naturlig forekommende gyting perioden (for B. improvisus, dette er om sommeren). Innhentet Larvene kan brukes til å utføre et bredt sett av eksperimentelle studier, inkludert oppgjør analyser, atferd analyser, uttrykk studier på bestemte gener, samt genomet hele transcriptome studier.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av stipend 2017-04559 fra svenske Research Council (VR) og EU støttet prosjektet STRANDPROMENADEN til Anders Blomberg. Spesielt etableringen av culturing anlegget har gjennom årene blitt støttet av tilskudd til Per R. Jonsson fra de følgende virkemiddelaktører: SSF (svensk Foundation til strategisk forskning) gjennom programmet Marin vitenskap og teknologi og MISTRA gjennom programmet maritim maling. Kent Berntsson var medvirkende i de tidlige fasene av culturingfacility. Ytterligere finansiering for å etablere culturing anlegget har kommet fra sentrum for Marine evolusjonsbiologi (www.cemeb.science.gu.se), som er støttet av Linnaeus stipend fra svenske forskningsråd FORMAS og VR.
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
1.5-L PET bottle | |||
Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |