El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

1. colección de percebes adultos en el campo para comenzar un nuevo reproductores Implementar paneles transparentes de termoplástico (poli metil metacrilato) (110 x 110 x 1,5 mm3) en ≈ 1 – 3 m de profundidad en aguas tranquilas para recoger percebes adultos del campo. Marcos de uso que pueden tener varios paneles (figura 2A), perfore 2 agujeros (con un diámetro de 6 mm) en las esquinas superiores de cada panel y attachthepanelstotherackusingcableties. Así, thepanelswillhangverticallyin el agua. Cuando el establecimiento de percebes ha ocurrido (identificados como pequeños puntos blancos duros en los paneles), dejar los paneles durante al menos 2-3 semanas para asegurarse de que los percebes son grandes suficiente (5 mm) para ser transferidos al laboratorio sin tener seco o dañado. Poner los paneles en el laboratorio cuando se cubren con colocado B. improvisus que han alcanzado un tamaño de ca. indiameter de 5 mm.Nota: El tiempo para los adultos desarrollar a 5 mm en el campo es altamente dependiente de la disponibilidad de alimento y la temperatura. Normalmente, esto toma aproximadamente 3 semanas en el laboratorio de investigación marina de Tjärnö (58.87 ° N, 11.14 ° E). Comúnmente, los paneles para los nuevos reproductores generalmente son desplegados a finales de junio y recogidos a finales de agosto. Limpiar antes de introducir los paneles en el centro de la cultura, otros organismos de los paneles. Es más importante eliminar otras especies de percebes. Tenga en cuenta que es importante limpiar con frecuencia los paneles para eliminar contaminantes especies durante el cultivo, ya que esto aumentará significativamente las posibilidades de supervivencia de los reproductores. Coloque los paneles en posición vertical sobre el borde en un soporte con ranuras fresadas en una bandeja de polietileno (400 x 400 x 20 mm3) (figuras 2 y 2E). Las ranuras en el stand son 15 mm de separación. Para preparar las bandejas, hacer un puerto de entrada en la base y un puerto de salida en la parte superior en el lado opuesto de cada bandeja. Conecte el puerto de entrada de cada bandeja para un depósito de 100 L que contiene aproximadamente 30 L de agua con una entrada de agua de mar abierto a 20 ° C para permitir un flujo a través a una velocidad de ca. 2 L por minuto.Nota: Hasta 8 bandejas fueron conectados a un único depósito de 100 L. Conecte el depósito de 100 L para agua de mar control de temperatura (20 ° C) (p. ej., proporcionada por una bomba de calor el intercambio de calor de la agua de mar entrante).Nota: El percebe B. improvisus puede crecer y reproducirse en una salinidad marina completo (30 – 35 psu); sin embargo, la reducción de la salinidad a ca. 25 psu mediante la adición de agua dulce para el depósito de 100 L aumenta la producción de larvas de la cultura. 2. a partir de las nuevas generaciones de adultos de Cyprids cultivadas Cubos de construcción de los paneles termoplásticos de abrirán en la parte superior por cintas de 5 paneles utilizando una cinta no tóxico, resistente al agua. Coloque el cubo en una bandeja pequeña (en caso de fugas) y llenarlo con agua de mar (25 psu). Mantener el agua a temperatura ambiente (ca. 20 ° C). Añadir aproximadamente 200 cyprids en la parte superior del cubo. Alimentación de los juveniles con 100 mL de Skeletonema marinoi cada otro día (ver paso 5) mientras que en el cubo.Nota: Percebes menores pueden tener dificultades con la ingestión de Artemia salina (ver paso 3) ya que son grandes y, por tanto, difíciles de tragar para un Percebe recién colocado. Cambie el agua 1 x una semana. Después de 2 semanas, cuando los paneles contienen juveniles bastante establecidos de al menos 5 mm de diámetro, desarmar el cubo y poner los paneles con los juveniles de bandejas con flujo throughseawater y después de eso, los percebes de la alimentación con nauplios de a. salina . 3. cultura de nauplios de Artemia salina como alimento para adulto de percebes Establecer un sistema de cultivo para a. salina utilizando una botella de plástico de 1.5 L donde el bottomis cortado y se coloca la botella boca abajo en un soporte e iluminado desde el lado. Ajuste el cuello de botella en un tubo de silicona con una pinza y coloque una bomba de aireación (figura 2D). Para eclosionar los huevos, añadir unos 15 mL de los huevos de reclinación seco de Artemia a 1 L ofseawater.Nota: Artemia huevos traman en las larvas Nauplio después de 24 – 48 h. Para retrasar la eclosión de los nauplios de a. salina (p. ej., durante los fines de semana), se puede apagar la luz para reducir ligeramente la temperatura. Para cosechar los nauplios de Artemia , apague la aireación y oscurecer la parte superior de la botella con papel de aluminio (o similar p. ej., una lata)… Iluminar que la parte inferior de la botella para 10 minutos Hatched Artemia nauplii nadará hacia la luz. Los quistes no eclosionados se hundirán hasta el fondo, y cáscaras de quiste flotará en la superficie. Abra la abrazadera en la parte inferior. Recoja la fracción intermedia como una población densa de los nauplios de la natación.Nota: Todos los días (excepto los fines de semana), 1 L de la suspensión densa de nauplios de Artemia se agregó manualmente al depósito 100 L conexión a las bandejas con los percebes adultos. Evitar cualquier alimentación con cáscaras vacías del quiste, ya que no proporcionan la nutrición y principalmente resultado de la necesidad de limpiar la cultura a intervalos más frecuentes. 4. recogida y cría de larvas de Percebe Limpiar los paneles con percebes adultos por suavemente rociándolas con agua dulce y, si es necesario, eliminar cualquier suciedad de los paneles usando un cepillo de dientes suave y conchas de percebes. También, limpiar las bandejas (sin percebes) y tubos en caliente (75 º C) agua dulce. Colocar un tamiz de 90 μm plancton-red pegada al extremo de un tubo de PVC cortado (16 cm de diámetro, 15 cm de altura) en una bandeja de polietileno (30 x 20 x 10 cm3) con un puerto de desbordamiento. Recoger las larvas B. improvisus en el tamiz de la noche a la mañana (figura 2C).Nota: El tamiz se coloca justo debajo de la abertura de salida de la bandeja de los paneles de Percebe para recibir el agua limpiado y filtrar los nauplios. Las larvas permanecieron en el tamiz, mientras el agua de mar desbordó la bandeja pequeña. Esta bandeja pequeña asegura que el tamiz nunca deshidratado. Coloque un cubo de 30 L en un baño de agua donde la temperatura se mantiene a 26 ° C usando calentadores de tanque de peces de acuario (figura 2E). Aireación y agitación son asegurados por burbujeo de aire a través del sistema. Llenar la cubeta con 20 litros de agua de mar filtrado (0.2 μm; 25 psu). Añadir 1 L al cubo de una mezcla 60/40 de las microalgas 2 diatomeas, marinoi S. y C. gracilis (ver paso 5). Esto le dará una densidad inicial de aproximadamente 5 x 104 diatomeas por mL en el cubo.Nota: Las larvas nauplios de Percebe están fototáctica positiva. Los cubos fueron hechos de plástico blanco opaco con tapa que deja pasar algo de luz. Durante el invierno, la sala era iluminada durante el día (8:00 – 17:00), pero oscuro durante la noche. Durante el verano, la luz exterior entró en la habitación durante la mayor parte del día. Transferir lo recaudado B. improvisus nauplios a un plato de cristalización (300 mL; 50 mm de altura y 90 mm de diámetro). Iluminar el plato de al lado, que atraerá a las larvas a la fuente de luz. Recoger los nauplios de Percebe que se reúnen en la luz entrante con una pipeta y transfieren a otro plato de la cristalización. Retire cualquier resto larvas de Artemia . Transferencia de las larvas B. improvisus nauplios en un vaso con 1 L de agua de mar filtrado. Contar el número de nauplios por agitando el vaso suavemente para obtener una suspensión uniforme de las larvas y luego tomar cinco muestras de 1 mL de diferentes lugares en el vaso. Transferir cada muestra en una microplaca para una inspección visual con un estereomicroscopio. Contar el número de nauplios en cada una de las cinco muestras y agregan para arriba. Multiplique al número contado por 200 (1.000 mL/5 mL) para estimar cuántos miles de larvas se encuentran en la totalidad de la taza. Si hay muchas larvas Nauplio en el vaso, diluir la muestra hasta que la densidad es a más de 14.000 larvas/L (generalmente en el rango de 11.000-12.000 larvas/L). Añadir 1 L de B. improvisus nauplios a un cubo, añadiendo aproximadamente 11.000-12.000 larvas por cubo.Nota: Asegúrese de no añadir más nauplios, ya que esto resultará en escasez de alimentos en relación con las larvas y, por lo tanto, aumentar la mortalidad. Después de 3 días, recoger los nauplios de Percebe en un tamiz de 90 μm. Luego limpio el cubo (con 75 ° C agua dulce), llenar con agua de mar filtrada, agregar un nuevo feed de diatomeas (la misma cantidad que al principio) y finalmente agregar los nauplios otra vez. Cyprids empiezan a aparecer después de 6 días (± 1 día). Recoger cyprids primero con un tamiz de 90 μm (diseñado en punto 4.2 anterior). Luego separar los nauplios Percebe no muda y cyprids con un tamiz μm 320 encima de un tamiz μm 160. B. improvisus nauplios se acumulará en el 320 μm tamiz y cyprids en el tamiz de 160 μm.Nota: Las larvas de cyprid pueden ser almacenadas a 10 ° C en un plato la cristalización en la oscuridad para su uso posterior, hasta ca. 6 días. Sin embargo, el almacenamiento puede afectar la calidad y el rendimiento de las larvas de percebe, experimentos que comparan diferentes tratamientos idealmente deben utilizar larvas del mismo lote (y similar tiempo de almacenaje) para evitar confusión de efectos16. 5. cultivo de microalgas como alimento para las larvas Nauplio de Percebe Nota: Las algas fueron cultivadas en 3 diferentes tipos de culturas: () Banco de culturas, que son para el mantenimiento a largo plazo de las cepas que se utilizaban para la inoculación del escalamiento-para arriba; (ii) Inicio culturas, que son el primer paso en la escala; y finalmente (iii) la cultura de la producción, que es la escala de la producción final de grandes cantidades de algas como Percebe. Especies de diatomeas de la orden de la cultura colección de algas y protozoos (PACC) para ser utilizado como alimento para las larvas Nauplio de Percebe. La 2 especie marinoi Skeletonema (cepa 1077/5 de la CCAP) y Chaetoceros simplex var gracilis (1085/3 de la tensión CCAP) dan buenos resultados como alimento. Filtrar todo agua de mar para ser utilizado en los cultivos de algas, usando un sistema de filtro de cartucho con un tamaño nominal de poro de 0,2 μm. (el agua de mar filtrada es también para la incubación de los huevos de a. salina y el cultivo de las larvas Nauplio de barnacle). Autoclave el agua de mar filtrada para los cultivos de algas (a 105 ° C durante 5 minutos). Preparar un medio para el cultivo de microalgas, utilizando agua de mar esterilizada enriquecida con solución de f/2 de Guillard que contiene nutrientes inorgánicos, metales traza y vitaminas (véase Guillard 197517 para la receta detallada). Además, preparar una solución de silicato (Na2SiO3), pero mantener esto separado de enriquecimiento f/2 para prevenir una precipitación sólida.Nota: Las concentraciones de la solución madre de enriquecimiento y de la solución madre de silicato se prepararon para ser utilizado como una adición de 1 mL de cada uno a 1 L de agua de mar. Autoclave todo el equipo utilizado en el cultivo de algas a 120 ° C para tubos de ensayo de Autoclave Tapón Tornillo de 20 min con 1 mL de enriquecimiento f/2 y 1 mL de solución de silicato. Agregar las soluciones de silicato y enriquecimiento a theseawater cuando el material de vidrio esterilizado y líquidos se hayan enfriado a temperatura ambiente. Crecen cultivos stock de microalgas en tubos de ensayo de 40 mL con tapones de rosca. Llenar los tubos de ensayo con unos 30 mL de agua de mar enriquecido. Inocular los cultivos con una pipeta Pasteur estéril con aproximadamente 1 mL de un cultivo 2 semana de edad. El tapón es entonces equipado pero no apretado, para permitir un intercambio de gases. Si está disponible, la inoculación debe llevarse a cabo en una cabina de flujo laminar para reducir el riesgo de contaminación.Nota: El objetivo de los cultivos stock es mantener culturas algas sobre una base a largo plazo y servir como inóculo para iniciar cultivos. Cultivos stock nuevamente se inocularon cada 2 semanas. Exponer la nueva cultura común a una luz blanca con una intensidad de ca. 25-50 µmole m-2s-1 (con un ciclo de luz-oscuridad de h 16:8). Hacia las antiguas culturas stock una baja intensidad de luz como una copia de seguridad. Deseche cualquier culturas stock 2 semana de edad. Para el escalamiento a la cultura de la producción de algas, inocular los cultivos de inicio de la cultura común y crece en 500 mL Erlenmeyerflasks. Matraces de Erlenmeyer de autoclave 4 pipetas y tapones de algodón con 300 mL de agua de mar filtrado de (0.2 μm) y 4 tubos de ensayo con 0,3 mL de enriquecimiento f/2 y 4 con soluciones de silicato. Enfriar el enriquecimiento f/2 y el silicato a la temperatura ambiente y añadir las soluciones a los matraces de Erlenmeyer. Les inocule con ca. 1 mL del cultivo stock 2 semana de edad.Nota: Preparar 2 frascos con S. marinoi y 2 con C. simplex. Ponga los frascos sobre una mesa temblorosa en una intensidad de luz de 50 µmole m-2s-1. Cuando las culturas de inicio tienen poblaciones densas de algas (de color amarillo-café), están listos para utilizarse como inóculo para los cultivos de producción que el percebe las larvas con el alimento. Crecen cultivos de producción en botellas de policarbonato de 4 L con tapones de silicona con 2 puertos perforados provistos de tubos de vidrio. Conecte el tubo de vidrio 1 llegando a la parte inferior de la botella a una bomba de aire a través de un tubo de silicona, equipado con un filtro de 0.2 μm. Asegúrese de que el segundo tubo de vidrio termina justo debajo del tapón de silicona y se llena de algodón para permitir la salida de aire inyectado. Cada semana, relleno 4 L botellas con autoclave y agua de mar filtrada les junto con los tapones. Además, la prueba de autoclave 4 tubos con 4 mL de las soluciones de silicato y enriquecimiento f/2. Después de enfriar, añadir las soluciones de silicato y enriquecimiento f/2 a las botellas y luego los inocular con la mitad del volumen de las culturas de la puesta en marcha en los matraces de Erlenmeyer. Coloque las cuatro botellas de 4 L en una intensidad de luz de 50 – 100 µmole m-2s-1. Cosecha los cultivos de producción después de ca. 1 semana; entonces son lo suficientemente densos para ser utilizado para la alimentación del Percebe las larvas Nauplio.Nota: Las culturas de producción tienen una vida útil de aproximadamente 2 semanas, que significa que hay 8 botellas de producción activa en cualquier momento. 6. diseño de estudios experimentales con percebes Coloque los paneles con percebes juveniles o adulto en el acuario controlado donde se puede cultivar bajo identicalconditions. Esto se llama un experimento de jardín común, que, por ejemplo, puede utilizarse para entender adaptaciones locales o plasticidad fenotípica18, o para estudiar cambios de expresión génica en relación con factores externos (por ejemplo, salinidad, temperatura o pH).Nota: También es posible utilizar percebes recogidos directamente del campo de paneles. Una ventaja de la utilización de individuos criados en laboratorio es que efectos maternos pueden evitarse cuando se usa la siguiente generación de la prole. Exponer percebes a las condiciones ambientales específicas durante un intervalo de chosentime, seguido por la recolección de los adultos (p. ej., estudios sobre la expresión génica)2. Para los experimentos con larvas de cyprid para el estudio de la expresión de gen3, coloque el cyprids en acuarios controlados donde se pueden cultivar larvas bajo condiciones idénticas. La cyprids de la cosecha después de períodos de tiempo especificados por filtración con tamices (como se describe en el paso 4.7) y extracto de RNA según los protocolos siguientes (paso 8). 7. disección de percebes Limpiar el espacio en el laboratorio donde se realizaban la disección y toma de muestras de ADN, bothbefore y entre los individuos, incluyendo todas las herramientas de disección. Esto se hace con cloro para el Banco (o etanol de 96% para el fórceps).Nota: Tubos con medios de fijación (etanol o con una solución de estabilización de RNA) se preparan de antemano. Seleccionar a individuos hambrientos grandes y a corto plazo (no darles de comer durante 2 días antes de la disección). Limpie la carcasa del Percebe con un cepillo de dientes para reducir al mínimo el riesgo de contaminación de otras especies (p. ej., bacterias, algas) y enjuagar con agua.Nota: La razón para el hambre a corto plazo de los individuos antes de la disección evitar cualquier contaminación de ADN (por ejemplo, de quistes de Artemia en el intestino). Coloque los percebes individuales sobre una superficie plana, ya sea conectada a un panel o suelta en un plato. Disecar los tejidos respectivos del adulto. Hay varias formas de disecar percebes, dependiendo de la finalidad del estudio. Método de disección A: fijación del Percebe todo lo antes posible. Quitar el percebe todo desde el panel mediante un bisturí, insertarlo en el percebe y cerca de la superficie del panel.Nota: En la mayoría de los casos, esta manipulación deja la placa basal casi intacto, no afectando el percebe dentro. Romper cuidadosamente la cáscara externa de un lado insertando fórceps (figura 3). Esto se hace para facilitar la intrusión de un medio de fijación dentro de la cáscara.Nota: Si la cáscara no se rompe en todos antes de colocar el percebe en un tubo de ensayo, puede llevar a un proceso de fijación más lento y una calidad inferior de ADN más adelante. Poner los percebes rotos en el tubo de ensayo que contiene una solución de almacenamiento de RNA o etanol. Deje el percebe en la solución durante al menos 24 h para su fijación. Cuando se fija el percebe, el animal puede ser sacado de los medios de fijación y coloca en una bandeja de disección. Los cirros, manto y soma (cuerpo) pueden separados entre sí y colocados en tubos separados para más extracciones de ADN o ARN.Nota: Es importante observar si existen laminillas de huevos con huevos fecundados dentro el percebe. Si está presente, estos deben ser removidos antes de proceder a las extracciones de ADN para evitar encontrar múltiples genotipos en la muestra. Método de disección B: quitar el percebe de la cáscara antes de su fijación.Nota: Este método no siempre resultar en el manto se muestra ya que se une al interior de la calcareousshell. Pero puede ser un método rápido para el muestreo de ADN de un individuo. Retire con cuidado, utilizando pinzas de disección, las placas tergal y scutal (figura 3) introducir la punta de las pinzas entre las placas tergal y scutal, agarrando la mano de una placa y tirando suavemente para eliminarlos. El asimiento de los cirros con fórceps y extracción del Percebe directamente hacia afuera y colóquelo directamente en etanol al 96% o estabilizar la solución para la fijación de la RNA…Nota: A veces, el manto será también degustar al mismo tiempo, como se ha visto como un epitelio delgado con pigmentación oscura (en B. improvisus). De lo contrario, el manto puede quitar desde el interior de la cáscara con un bisturí y, después de eso, colocar en etanol o estabilizar la solución de RNA.Nota: Las placas tergal y scutal (si intacto) pueden ser secadas y guardadas ya que son útiles para la identificación de las especies10. Una recomendación general, si hay alguna duda de las especies, es también fotografiar el percebe todo antes de inicializar la disección. 8. ARN extracción para PCR cuantitativa Poner adultos para ser utilizado para las extracciones de RNA en un RNA estabilizar solución incúbelos durante la noche (hasta 24 h) a 4 ° C y luego almacenarlas a-80 ° C.Nota: Cyprid larvas son preferentemente seco congelado, sin RNA más tarde directamente en-80 ° C, colocándolas en criotubos y luego sumergir los tubos brevemente (30 s) en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a-80 ° C. En el momento de la extracción de RNA, descongelar los percebes en el hielo y usarlos intacto o diseccionar a los tejidos que se utilizará (ver paso 7).Nota: debido a la alta diversidad genética entre individuos (≈ 3 – 5% variación codificación regiones; Rosenblad ALM et al., datos no publicados) es aconsejable poola número de individuos adultos, lo que minimiza el efecto de la variación de la secuencia entre individuos en el paso posterior de la qPCR. Para la RNAextraction, añadir 350 μl de tampón de lisis suministrado con un kit de preparación de RNA en tubos de homogeneización con 2,8 mm de cerámica.Nota: Granos de cerámica proporcionan un mejor rendimiento del ARN frente a sonicación (Representante de resultados). Un Percebe adulto (conjunto o tejidos) o recoger un mínimo de 20 larvas de cyprid con unas pinzas y colocar en tubos de homogeneización. Proceder directamente a la interrupción y la homogeneización con un molino de grano. Poner los tubos de homogeneización con la muestra y los granos en el soporte de molino de grano. Agitar ellos con una frecuencia de 4.0 m/s durante 20 s. Cool la muestra durante 1 min en hielo. Repetir x 2. Preparar el RNA según el protocolo del kit de aislamiento de RNA comercialmente disponible.Nota: Debe realizarse una evaluación del riesgo (incluyendo la lectura de las hojas de datos de seguridad) antes de utilizar métodos de extracción de RNA, para identificar sustancias químicas peligrosas que requieren el uso de una campana de humos y otra ropa de protección, incluyendo guantes (p. ej., la adición de β-mercaptoetanol en el búfer de lisis durante la extracción de RNA se debe realizar en una campana de humos). Cuantificar el ARN. Preparar una solución de trabajo y agregar un estándar y las muestras para un volumen total de 200 μl. Vortex por 2 – 3 s e incúbelos durante 2 minutos insertar los tubos en un fluorómetro y tomar lecturas. Consulte las muestras de RNA para cualquier contaminación de proteína con un espectrofotómetro y comprobar su integridad del RNA con un sistema automatizado de electroforesis (Representante de resultados).Nota: Para los preparados de buena calidad, RNA recomienda tener una proporción de 260/280 nm de 2 – 2,2 y un ADN de alrededor de 1.8. Valores menores indican contaminación de proteína y que el procedimiento de extracción tiene que ser optimizado. 9. Gene expresión: cDNA síntesis y qPCR Tratar la DNasa RNAwith obtenidos para eliminar cualquier remainingDNA antes de hacer el cDNA para qPCR. Compruebe la contaminación de ADN genómico mediante la adición de una muestra de RNA pero no de la transcriptasa reversa al preparar el cDNA. Si hay una amplificación por PCR del gen seleccionado en el cDNA sin transcriptasa inversa, existe contaminación del ADN en el ARN.Nota: Para que muestras para RNA-seq (RNA-secuenciación secuenciación de próxima generación de tecnología), el paso de DNasa es menos crítico. En particular, para las muestras con niveles bajos de ARN, el paso de DNasa puede omitirse para no perder demasiado el ARN en el proceso. Realizar síntesis de cDNA usando una cantidad de ARN dentro del intervalo especificado en el comercial cDNA síntesis kit, pero por lo general, uso menos de 50 ng de RNA tratado con DNasa. Diseño de cartillas de qPCR para que recuece a partes del gen de interés donde la identidad de secuencia entre individuos es tan alta como sea posible, pero la identidad de secuencia entre gene paralogs es tan baja como sea posible. Consulte las publicaciones correspondientes para las parejas de primer específicas utilizadas para estudios de expresión génica de Na+k+ ATPasa3 y aquaporins2 (figura 5).Nota: Para este propósito, pueden utilizarse datos de la secuencia de RNA-seq de cientos de cyprids o varios adultos. Cartillas de diseño para un gen para la normalización de los niveles de expresión (p. ej., actina). Son los iniciadores utilizados con éxito para la actinia, adelante: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3′ y hacia atrás: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′.Nota: La actina es un gen de control habituales. Sin embargo, otros también se han sugerido como referencia y probado en percebes19. Además de actina, el uso de RPL8 36B4, EF1 y NADHd1 como referencia ha sido probado3. Se concluyó que no hay diferencias grandes en los niveles de expresión de los genes de referencia respectivos entre soma, cirros, adulto o cyprids. Optimizar la temperatura de recocido para los cebadores diseñados mediante la adición de cantidades crecientes de cDNA (típicamente en el rango de 0.25 – 50 ng) de una mezcla que contiene el SYBR Green, polimerasa, dNTP y 0.3 μm de primer avance y retroceso. Ejecutar protocolos de qPCR a diferentes temperaturas de recocido como sigue: una temperatura de desnaturalización inicial de 95 ° C por 3 min, un paso de desnaturalización a 95 ° C por 20 s, recocido a temperaturas de 55 a 63 ° C por 20 s y una elongación a 72 ° C por 30 s. En total, ciclo 40 ciclos PCR.Nota: Primer eficiencia debe mentir en la gama de 90-105% y se calcula como E = (10^(-1/slope)-1) x 100 donde la inclinación es la pendiente de la curva obtenida al trazar el valor de registro de las concentraciones de cDNA contra sus valores de ciclo umbral (Ct). Realizar qPCR utilizando una cantidad adecuada de cDNA, generalmente 1-10 ng, usando el protocolo PCR descrito en el paso 3 con la temperatura de recocido óptimo encontrada.Nota: Sólo se utiliza la mayor cantidad de cDNA de genes que se expresan en cantidades muy bajas.