JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Umwelt

Barnacle Balanus improvisus som Marine modell - dyrking og genuttrykk

Published: August 08, 2018
doi:
10.3791/57825
, , , , ,
1Department of Marine Sciences,University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology,University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

Summary

Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er en modell for å studere osmoregulation og antifouling. Imidlertid gir naturlige sesongmessige gyting en uforutsigbar tilførsel av cyprid larver. Her, er en protokoll for alle året rundt dyrking av B. improvisus beskrevet, inkludert produksjon av larver. Bruk av kultivert barnacles i gene expression studier er illustrert.

Abstract

Barnacles er marine krepsdyr med et fastsittende voksen og frittlevende, planktoniske larver. Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er særlig relevant som modell for studiene i osmoregulatory mekanismer på grunn av sin ekstreme toleranse for lav saltholdighet. Det er også mye brukt som modell for å bosette biologi, spesielt i forhold til antifouling forskning. Imidlertid gir naturlige sesongmessige gyting en uforutsigbar tilførsel av cyprid larver for studier. En protokoll for alle året rundt dyrking av B. improvisus er utviklet og en detaljert beskrivelse av alle trinnene i produksjonslinjen markeres (dvs., etablering av voksen kulturer på paneler, samlingen og stell av Barnacle larver, og administrasjonen av mate for voksne og larver). Beskrivelsen også gir veiledning om feilsøking og diskuterer kritiske parametere (f.eks, fjerning av forurensning, produksjon av høy-kvalitet mate, bemanning for og betydningen av høy kvalitet sjøvann). Hvert parti fra culturing systemet maksimalt gir omtrent 12.000 nauplii og kan levere fire bunker i en uke, så opp til nesten 50.000 Larvene per uke kan produseres. Metoden som brukes til kultur B. improvisus er sannsynligvis, i stor grad gjelder også for andre marine dyr med gratis-swimminglarvae. Protokoller er presentert for Disseksjon av ulike vev fra voksne samt produksjon av høy kvalitet for studier av genuttrykk. Det er også beskrevet hvordan kulturperler voksne og reared cyprids kan benyttes i en rekke eksperimentelle design for å undersøke genuttrykk i forhold til eksterne faktorer. Bruk av kultivert barnacles i genuttrykk er illustrert med studier av mulig osmoregulatory roller av Na+/K+ ATPase og aquaporins.

Introduction

Barnacles er marine krepsdyr med et fastsittende voksen og frittlevende, planktoniske larver. De fleste 1.200 arter med rur bor grunt vann, og mange er ofte utsatt for lav saltholdighet. Én art, bay barnacle Balanus (Amphibalanus) improvises (B. improvisus), kan tåle nesten ferskvann og Charles Darwin beskrevet denne arten fra en liten bekk i elvemunning av Rio de la Plata i Uruguay1. Ekstreme toleranse tolow saltholdighet gjør B. improvisus spesielt relevant modell for studiene osmoregulatory mekanismer2,3. Denne barnacle foretrekker brakkvann forhold, men kan leve i vann med salinitet fra rundt 1,6 psu til så høyt som 40 psu4. Det er den eneste barnacle arten finnes i brakkvann Østersjøen. B. improvisus antas å stamme fra østkysten av det amerikanske kontinentet, men i dag er funnet over hele verden på grunn av spredning av shipping5. Det er en stor begroing organisme er vanligvis funnet på steiner, brygger og båtskrog og er derfor av generell interesse for å forstå mekanismene av biofouling på konstruksjoner i marint og brackish vann6,7.

I likhet med de fleste andre RUR, B. improvisus er hermafroditter med cross-fertilization; reproduksjon oppstår gjennom parring mellom nærliggende personer som bruker en langstrakt penis og indre befruktning. Reproduktive perioden er hovedsakelig fra mai til September. B. improvisus har syv pelagisk larver stadier (seks nauplii etterfulgt av en cyprid trinn8). Befruktede egg lukene i en nauplius Larven som frittlevende og feeder i kolonnen vann for opptil flere uker før molting i en ikke-fôring cyprid larve. Cyprid bruker flere signaler til å finne et egnet sted å bosette seg og deretter gjennomgår metamorfose i fastsittende juvenile barnacle9. Arten kan være kulturperler i laboratoriet og har en levetid på 1-2 år i havet (2-3 år i laboratory kultur). Gjennomsnittlig B. improvisus vokser til 10 mm diameter (med maksimalt rundt 20 mm), og når en maksimal høyde ca 6 mm (selv om det kan bli høyere under overfylt forhold). Arten kan bli identifisert av sin glatt kalkholdig selv shell (hvit eller grå), radiellt mønstret kalkholdig base av shell plate, og formen på tergal plater1,10.

Barnacle B. improvisus har flere fordel funksjoner som en modell for studier av osmoregulation, med fokus på molekylære og fysiologiske mekanismene som økologiske interaksjoner og evolusjonære konsekvenser. Det er også mye brukt som modell for undersøkelser for å bosette biologi, spesielt i forhold til antifouling forskning og mekanismer involvert7,11,12,13. Imidlertid gir naturlige sesongmessige gyting en uforutsigbar tilførsel av cyprid larver for studier. Muligheten til å kultur denne barnacle gjennom livssyklusen hele året er derfor et stort aktivum aktivere ulike typer molekylære og mekanistisk studier. I tillegg gir sin tilstedeværelse i marine/brakkvann verdensomspennende en kombinasjon av felt og eksperimentelle studier. Kontrollert avl kan også produsere familier av kjente stamtavler for langsiktig dyrking14, og gangen generasjon av noen få måneder kan langsiktige eksperimentelle utviklingen. Det finnes også et utkast genom og flere transcriptomes, og disse ressursene er brukt for kloning av flere gener (f.eks, gener av betydning i osmoregulation)2,3.

Målet med denne protokollen er å beskrive hvordan å etablere og opprettholde en kultur for barnacle B. improvisus hele året for å utføre gene expression studier på voksne eller larver av denne organismen. Rittschof et al. 15 kort beskrevet en metode for dyrking barnacles fra utgivelsen av nauplii til oppgjør av cyprids for arten Balanus amphitrite. Protokollen er tilpasset alle året dyrking av B. improvisus på Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige), og en detaljert beskrivelse av alle trinnene i produksjonslinjen markeres, inkludert produksjon og stell av barnacle Larvene, i tillegg til administrasjonen av mate for voksne og larver. En oversikt over den komplette prosedyren, se figur 1. Bruk av culturing systemet er eksemplifisert med noen vanlige eksperimentelle oppsetninger og illustrert i funksjonell genomforskning studier av Na+/K+ ATPase og aquaporins, Klargjørende deres mulige funksjoner i osmoregulation2, 3. Det er noen ganger nødvendig å undersøke genuttrykk bestemt vev, og noen av grunnleggende barnacle disseksjon vil bli dekket. Med god tilførsel av høy kvalitet sjøvann, bør dyrking av barnacle B. improvisusog potensielt mange andre arter, være mulig i marine laboratorier over hele verden.

Protocol

1. innsamling av voksen Barnacles i feltet for å starte en ny stamfisk Distribuere termoplast (poly-methyl methacrylate) gjennomsiktige paneler (110 x 110 x 1,5 mm3) på ≈ 1-3 meters dyp i rolige farvann for å samle voksen barnacles fra feltet. Bruk rammer som kan ta flere paneler (figur 2A), bore 2 hull (med en diameter på 6 mm) i de øverste hjørnene av hvert panel og attachthepanelstotherackusingcableties. Dermed thepanelswillhangverticallyin vannet. Når oppgjør av barnacles oppstod (identifisert som små hvite vanskelig prikker på paneler), la panelene i minst 2-3 uker å sikre at barnacles er stor nok (5 mm) skal overføres til laboratoriet uten å bli tørket eller skadet. Få panelene i laboratoriet når de er dekket med utlignede B. improvisus som har nådd en størrelse på ca. 5 mm indiameter.Merk: Tiden for voksne å utvikle til 5 mm i feltet er svært avhengig av tilgjengeligheten av mat og temperaturen. Normalt, dette tar ca 3 uker ved Tjärnö Marine Research Laboratory (58.87 ° N, 11.14 ° E). Oftest er paneler for den nye stamfisk vanligvis distribuert i slutten av juni og samlet på slutten av August. Før innføring av ren panelene i kultur anlegget, andre organismer fra panelene. Det er det viktigste å fjerne andre barnacle arter. Vær oppmerksom på at det er viktig å rengjøre ofte paneler til å kvitte seg med forurensende arter under dyrking ettersom dette signifikant øker sjansene for overlevelse av Ynglestammen. Plassere panelene loddrett på kant i et stativ med valset spor i en polyetylen skuff (400 x 400 x 20 mm3) (tall 2C og 2E). Sporene i stativet er 15 mm fra hverandre. For å forberede magasinene, gjør en inngang på basen og en exit port øverst på motsatt side av hver skuff. Koble inngangen havnen i hver skuff til et 100 L reservoar som inneholder ca 30 L vann med en vik åpne sjøvann ved 20 ° C for å tillate en flyt gjennom med en hastighet på ca. 2 L per min.Merk: Opptil 8 brett var knyttet til en enkelt 100 L-reservoaret. Koble 100 L reservoaret til temperaturkontrollert sjøvann (20 ° C) (f.eks fra varmepumpe utveksle varmen fra innkommende sjøvannet).Merk: Barnacle B. improvisus kan vokse og reprodusere en full marine saltholdighet (30 – 35 psu); imidlertid redusere saltholdighet til ca. 25 psu ved å legge til ferskvann til 100 L reservoaret øker produksjonen av larver fra kulturen. 2. Start nye generasjoner av voksne på kulturperler Cyprids Lage kuber av termoplastisk paneler åpne på toppen av taping 5 panelene sammen med en ikke-giftig, vannavstøtende tape. Plasser kuben i en liten skuff (ved lekkasje) og fyll den med sjøvann (25 psu). Holde vannet ved romtemperatur (ca. 20 ° C). Legge til omtrent 200 cyprids øverst i kuben. Feed yngelen med 100 mL Skeletonema marinoi annenhver dag (se trinn 5) mens i kuben.Merk: Juvenile barnacles kan ha problemer med inntak Artemia salina (se trinn 3) siden de er store, og derfor vanskelig å svelge for en nylig utlignede barnacle. Endre vannet 1 x i uken. Etter 2 uker når panelene inneholder nok etablerte yngel minst 5 mm i diameter, ta kuben fra hverandre og flytte paneler med yngelen til kabelrenner flyt-throughseawater, og deretter mate barnacles med A. salina nauplii. 3. kultur av Artemia salina Nauplii som Feed for voksen Barnacles Definere et culturing system for A. salina ved hjelp av en 1,5 L plast flaske der bottomis kuttet og flasken plasseres opp-ned i et stativ og opplyst fra siden. Passer flaskehalsen slik silisium med en klemme og fest den til en lufting pumpe (figur 2D). For å klekkes eggene, legge til ca 15 mL av tørr hvile egg av Artemia 1 L ofseawater.Merk: Artemia egg klekkes i nauplius larvae etter 24 48 h. For å utsette Luke av A. salina nauplii (f.eksi helgene), kan lyset slås av for å redusere temperaturen litt. For å høste Artemia nauplii, deaktivere lufting og mørkere øvre del av flasken med aluminiumsfolie (eller lignende f.eksen boks). Belyse den nedre delen av flasken for 10 min. Hatched Artemia nauplii svømmer mot lyset. Non-klekket cyster vil synke til bunns, og cyste skjell flyter på overflaten. Åpne klemmen nederst. Samle mellomliggende brøken som et tett befolket av svømming nauplii.Merk: Hver dag (unntatt i helgene), 1 L tett Artemia nauplii suspensjon manuelt lagt til 100 L reservoaret kobler til skuffene med voksen RUR. Unngå alle mate med Tom cyste skjell, siden de ikke gir ernæring og hovedsakelig føre trenger å rense kultur mer jevnlig. 4. innhenting og stell av Barnacle larver Feilfri paneler med voksen barnacles ved å forsiktig sprøyte med ferskvann, og eventuelt fjerne alle begroing fra barnacle skall og panelene med en myk tannbørste. Også rengjøre skuff (uten RUR) og rør i varme (75 ° C) ferskvann. Plassere en sil laget av 90 µm plankton-nettet limt til slutten av en kuttet PVC-rør (16 cm i diameter, 15 cm i høyden) i en polyetylen skuff (30 x 20 x 10 cm3) med en overflyt port. Samle B. improvisus larver i silen natten (figur 2C).Merk: Silen var plassert rett under Avslutt havnen i skuffen barnacle panelene å få utstrømmende vann og filtrerer ut av nauplii. Larvene forble i silen mens sjøvannet overfløt små magasinet. Denne liten skuff sikres at silen aldri driedout. Plass en 30 L bøtte i et stort vannbad der temperaturen er opprettholdt på 26 ° C med akvariet fisken tank varmeovner (figur 2E). Lufting og agitasjon er sikret av luft-bobler i systemet. Fyll bøtte med 20 L filtrerte sjøvann (0,2 µm, 25 psu). Legge 1 L til bøtte med en 60/40 blanding av 2 slektene mikroalger, S. marinoi og C. gracilis (se trinn 5). Dette vil gi en første tetthet av ca 5 x 104 kiselalger per mL i bøtte.Merk: Barnacle nauplii Larvene er positivt phototactic. Bøtter var laget av ugjennomsiktig hvit plast med lokk som la gjennom lys. Om vinteren ble rommet tent på dagtid (8:00-17:00), men mørk under nighttime. Sommeren kom utenfor lyset i rommet under mesteparten av dagen. Overføre de innsamlede B. improvisus nauplii til en størkner rett (300 mL, 90 mm i diameter, 50 mm i høyden). Lyse opp parabolen fra siden som vil tiltrekke Larvene til lyskilden. Samle barnacle nauplii som samles på innkommende lys med en pipette, og overføre dem til en annen størkner rett. Fjern alle gjenværende Artemia larver. Overføre B. improvisus nauplii Larvene til et beaker med 1 L filtrerte sjøvann. Telle antall nauplii stirring begeret forsiktig for å få en med suspensjon av larver og deretter ta fem 1 mL eksempler fra forskjellige steder i begeret. Overføre hvert utvalg i en microplate for en visuell inspeksjon med en stereomicroscope. Antall nauplii i hver av de fem prøvene og legge dem. Multipliser det opptalte antallet med 200 (1000 mL/5 mL) å anslå hvor mange tusenvis av Larvene er i hele begeret. Hvis det er for mange nauplius larver i begeret, fortynne prøven før tettheten er høyst 14.000 Larvene finans (vanligvis i størrelsesorden 11.000-12.000 Larvene/L). Legge til 1 L B. improvisus nauplii i en bøtte, dermed legge lag 11.000-12.000 Larvene per bøtte.Merk: Sørg for ikke å legge mer nauplii, siden dette vil medføre for lite mat i forhold til larvene, og dermed øke dødelighet. Etter 3 dager, samle barnacle nauplii på en 90 µm sil. Rengjør bøtte (med 75 ° C ferskvann), fylle den med filtrerte sjøvann, legge til en ny slektene feed (det samme beløpet som i starten) og til slutt legger nauplii igjen. Cyprids begynner å vises etter ca 6 dager (± 1 dag). Samle cyprids først med en 90 µm sil (designet som punkt 4,2 ovenfor). Deretter Skill ikke-moulted barnacle nauplii og cyprids med en 320 µm sil over en 160 µm sil. B. improvisus nauplii samler i 320 µm sil og cyprids i 160 µm silen.Merk: Cyprid Larvene kan lagres på 10 ° C i en størkner rett i mørket for senere bruk, opp til ca. 6 dager. Lagring kan imidlertid påvirke kvaliteten og ytelsen av barnacle larvene, så eksperimenter sammenligne forskjellige behandlinger bør ideelt sett bruke larver fra samme batch (og lignende lagringstid) å unngå forvirrende effekter16. 5. kultur av mikroalger som Feed for Barnacle Nauplius larver Merk: Alger ble dyrket i 3 forskjellige typer kulturer: (i) lager kulturer som for langsiktig vedlikehold av stammer som ble brukt for inoculation av skalering-up; (ii) start kulturer, som er det første trinnet i skalere opp; og til slutt (iii) produksjon kultur, som er endelig produksjon omfanget av store mengder alger som barnacle feed. Bestille slektene arter fra kultur samling av alger og protozoer (CCAP) som skal brukes som fôr til barnacle nauplius larvene. 2 arten Skeletonema marinoi (CCAP belastning 1077/5) og Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP belastning 1085/3) både gi gode resultater som feed. Filtrere alle sjøvann i alger kulturer, med en patron filtersystem med en nominell porestørrelse 0,2 µm. (filtrert sjøvannet er også brukes for klekking A. salina egg og dyrking av barnacle nauplius larver.) Autoclave filtrerte sjøvannet for alger kulturer (på 105 ° C i 5 min). Forberede en medium kulturen av mikroalger, med autoklaveres havvann beriket med Guillard’s f/2 løsning som inneholder uorganiske næringsstoffer, spor metaller og vitaminer (se Guillard 197517 for detaljert oppskrift). I tillegg utarbeide en løsning av silikat (Na2SiO3), men hold dette atskilt fra f/2 anriking å hindre solid nedbør.Merk: Konsentrasjonen av berikelse lager løsningen og lager løsning av silikat ble utarbeidet som en 1 mL tillegg til 1 L sjøvann. Autoclave alt utstyr brukes i alger kultur på 120 ° C for 20 min. Autoclave skruen-capped reagensglass med 1 mL f/2 berikelse og 1 mL silikat løsning. Legg den berikelse og silikat løsninger i theseawater når autoklaveres glass og væsker har kjølt ned til romtemperatur. Vokse lager kulturer av mikroalger i 40 mL reagensglass med skrulokk. Fyll reagensglass med ca 30 mL av beriket sjøvannet. Vaksinere kulturer med en bakteriefri Pasteur pipette bruker ca 1 mL av en 2 uker gamle lager kultur. Skrukork er da utstyrt men ikke strammet, for å tillate noen gassutveksling. Hvis tilgjengelig, gjennomføres inoculation i en laminær strømning regjering å redusere risikoen for forurensning.Merk: Målet med lager kulturer er å opprettholde alger kulturer på lang sikt og som inoculum for starte kulturer. Lager kulturer ble re inokulert annenhver uke. Utsette den nye lager kulturen til et hvitt lys med en intensitet av ca. 25-50 µmole m-2s-1 (med en lys og mørke syklus av 16:8 h). Flytt de gamle lager kulturene til lav lav intensitet som en sikkerhetskopi. Kast noen 2 uker gamle lager kulturer. Skalere opp til produksjon kultur alger, vaksinere start kulturer fra lager kulturen og dyrke dem i 500 mL Erlenmeyerflasks. Autoclave 4 Erlenmeyer flasker Pipetter og bomull stoppere med 300 mL filtrerte (0,2 µm) sjøvann og 4 reagensglass med 0,3 mL f/2 berikelse og 4 silikat løsninger. Kjøle ned f/2 berikelse og silikat til romtemperatur, og legge løsninger til Erlenmeyer flasker. Vaksinere dem med ca. 1 mL av to – ukers gamle lager kultur.Merk: Forberede 2 flasker med S. marinoi og 2 med C. simplex. Satt i flasker på en risting tabell i lav intensitet av 50 µmole m-2s-1. Når start kulturer har ervervet tett alger populasjoner (gul-brun på farge), er de klar til å brukes som inoculum for produksjon kulturer som vil gi barnacle Larvene med mat. Vokse produksjon kulturer i 4 L polykarbonat flasker med silikon stoppere med 2 boret porter med BILLEDRØR. Koble 1 røret nå til bunnen av flasken for å en luftpumpe via en silikon rør utstyrt med en 0,2 µm luftfilter. Kontroller at den andre glassrør ender rett under silikonpluggen og er fylt med bomull tillate avkjørselen injisert luft. Hver uke, flasker fylle fire 4 L med filtrerte sjøvann og autoklav dem sammen med stoppers. I tillegg rør autoklav 4 test med 4 mL f/2 berikelse og silikat løsninger. Etter avkjøling, Legg til f/2 berikelse og silikat løsninger flaskene og deretter vaksinere dem halvparten av volumet oppstart kulturer i Erlenmeyer flasker. Plass fire 4 L flasker med lav intensitet av 50-100 µmole m-2s-1. Høste produksjon kulturer etter ca. 1 uke; de er så tette nok til å brukes for fôring av barnacle nauplius larver.Merk: Produksjon kulturer har en levetid på ca 2 uker, noe som betyr at det er 8 aktive produksjon flasker til enhver tid. 6. design eksperimentelle studier med Barnacles Plasseres med juvenil eller voksen barnacles i kontrollerte akvarier der de kan dyrkes under identicalconditions. Dette kalles en felles-hage eksperimentet, som for eksempel kan brukes til å forstå lokale tilpasninger eller fenotypiske plastisitet18eller studere genet uttrykk endringer i forhold til eksterne faktorer (f.eks, saltholdighet, temperatur eller pH).Merk: Det er også mulig å bruke barnacles direkte samlet fra feltet på paneler. Fordelen med å bruke laboratorium-avlet individer er at mors effekter kan unngås ved neste generasjon av avkom. Utsette barnacles bestemt miljømessige forhold under et chosentime intervall, etterfulgt av høsting av voksne (f.eksfor studier av genuttrykk)2. For eksperimenter med cyprid larver å studere genet uttrykk3, plasserer du cyprids i kontrollerte akvarier hvor larvene kan være dyrket under like. Høste cyprids etter bestemte tidsperioder ved filtrering med sikter (som beskrevet i trinn 4.7), og ekstra RNA ifølge protokollene nedenfor (trinn 8). 7. Disseksjon av Barnacles Rengjør laboratoriet plass der disseksjon og DNA prøvetaking er utført, bothbefore og mellom individer, inkludert alle disseksjon verktøy. Dette gjøres ved hjelp av klor for benk (eller 96% etanol for tang).Merk: Merket rør som inneholder fiksering media (etanol eller en RNA stabilisering løsning) er forberedt på forhånd. Velg store og kortsiktige starved enkeltpersoner (ikke mate dem for 2 dager før dissection). Rengjør barnacle skallet med en tannbørste å minimere risikoen for forurensning fra andre arter (f.eks, bakterier, alger) og skyll den av med vann.Merk: Grunnen til den kortsiktige sult individer før dissection er å unngå enhver DNA kontaminering (f.eksfra Artemia cyster i tarmen). Plass de personlige barnacles jevnt underlag, festet til et panel eller løs i en rett. Dissekere respektive vev fra voksen. Det er flere måter å dissekere RUR, avhengig av formålet av studien. Disseksjon metode A: fikse det hele barnacle så raskt som mulig. Fjerne hele barnacle fra panelet ved hjelp av en skalpell, sette den under barnacle og overflaten.Merk: I de fleste tilfeller er dette manipulasjon blader basale platen nesten intakt, og dermed ikke påvirker barnacle inne. Nøye sprekk det ytre skallet på en side ved å sette tang (Figur 3). Dette gjøres for å lette inntrenging av et fixating medium i skallet.Merk: Hvis skallet ikke brytes hele før du plasserer barnacle i et reagensrør, det kan føre til et langsommere fiksering prosessen og en dårlig kvalitet DNA senere. Sette den ødelagte barnacle i reagensglasset som inneholder en RNA lagringsløsning eller etanol. Forlate av barnacle i løsningen for minst 24 timer for sin fiksering. Når barnacle er fast, kan dyret tas ut av fiksering media og plassert på en disseksjon skuff. Den cirri, kappe, og soma (body) kan skilt fra hverandre og plassert i egen rør for ytterligere utdrag av DNA eller RNA.Merk: Det er viktig å observere hvis egg lamellae med befruktede egg finnes inne barnacle. Hvis den finnes, bør disse fjernes før du fortsetter med DNA utdrag å unngå å finne flere genotyper i utvalget. Disseksjon metode B: fjerne barnacle fra skallet før sin fiksering.Merk: Denne metoden kan ikke alltid føre mantelen blir samplet siden det er festet til innsiden av calcareousshell. Men det kan være en rask metode for prøvetaking DNA fra et individ. Nøye fjerne, ved hjelp av disseksjon tang, tergal og scutal platene (Figur 3) ved å sette spissen av Tang mellom tergal og scutal platene, gripe tak i en plate og trekke forsiktig fjerne. Grip tak i cirri med tang og trekk barnacle rett ut og plassere den direkte i 96% etanol eller RNA stabilisere løsning for fiksering.Merk: Noen ganger mantelen vil også prøves på samme tid, sett som en tynn epitel med pigment (i B. improvisus). Ellers kan mantelen være fjernet fra innsiden av skallet ved hjelp av en skalpell og deretter plassert i etanol eller RNA stabilisere løsning.Merk: Tergal og scutal platene (hvis intakt) kan tørket og lagret siden de er nyttige for arten identifikasjon10. En generell anbefaling, hvis det er noen tvil om arter, er å også fotografere den hele barnacle før initialisering dissection. 8. RNA Extraction kvantitative PCR La voksne brukes til RNA utdrag i en RNA stabilisere løsning, ruge over natten (til 24 timer) på 4 ° C, og deretter lagre dem på-80 ° C.Merk: Cyprid larver er fortrinnsvis tørr-frosne, uten RNA senere i-80 ° C, ved å plassere dem i cryotubes og deretter submerging rør kort (30 s) i flytende nitrogen før du lagrer dem på-80 ° C. Ved RNA utvinning, tine RUR på is og bruke dem intakt eller dissekere ut vev brukes (se trinn 7).Merk: på grunn av høy genetisk mangfold mellom individer (≈ 3 – 5% variasjon i koding regioner. Alm Rosenblad et al., upubliserte data) er det tilrådelig å basseng antall voksne personer, som reduserer effekten av sekvens variasjon mellom individer i senere qPCR trinn. For RNAextraction, kan du legge 350 µL av lyseringsbuffer leveres med en RNA forberedelse kit i homogenisering rør som inneholder 2,8 mm keramisk perler.Merk: Keramisk perler gir en bedre avkastning av RNA sammenlignet med sonication (Representant resultater). Ta en voksen barnacle (hele eller vev) eller samle minst 20 cyprid larver ved hjelp av pinsett og sette dem inn i homogenisering rør. Gå direkte til avbrudd og homogenisering med en perle mill. Satte homogenisering rørene med eksempler og perler i perle mill holderen. Rist dem med en frekvens på 4.0 m/s for 20 s. Cool utvalget for 1 min på is. Gjenta 2 x. Forberede RNA i henhold til protokollen av kommersielt tilgjengelig RNA isolering kit.Merk: En risikovurdering (inkludert en lesning av HMS-Datablad) skal utføres før RNA utvinning metoder, til å identifisere farlige kjemikalier som krever bruk av avtrekksvifte og andre verneutstyr, inkludert hansker (f.eks, tillegg av β-mercaptoethanol til lyseringsbuffer under RNA utvinning skal utføres i avtrekksvifte). Kvantifisere av RNA. Forberede en fungerende løsning og legge en standard og prøver til et totalt volum på 200 µL. Vortex dem for 2-3 s ruge dem for 2 min. Sett inn rør i en fluorometer og ta målinger. Kontroller RNA prøvene for enhver protein kontaminering med et spektrofotometer, og deres RNA integritet med et automatisert geleelektroforese system (Representant resultater).Merk: For gode forberedelser, RNA anbefales å ha et forhold mellom 260/280 nm i 2-2.2 og en DNA på rundt 1,8. Lavere verdier angir protein forurensing og at utvinning prosedyren må optimaliseres. 9. genuttrykk: cDNA syntese og qPCR Behandle den fått RNAwith DNase for å fjerne alle remainingDNA før cDNA for qPCR. Sjekk for forurensende genomisk DNA ved å legge en RNA prøve men ingen revers transkriptase når forbereder cDNA. Hvis det er en PCR forsterkning av valgte genet på cDNA uten revers transkriptase, er det DNA forurensning i RNA.Merk: For prøver brukes til RNA-seq (RNA-sekvensering med neste generasjons sekvensering teknologi), det DNase trinnet er mindre viktig. Spesielt for prøver med lave nivåer av RNA, DNase trinnet kan utelates for ikke å miste for mye av det i prosessen. Utfør cDNA syntese DNase-behandlet RNA bruker en mengde RNA innenfor i kommersielle cDNA syntese kit, men vanligvis bruk minst 50 ng. Utforme qPCR primere slik at de anneal deler av genet av interesse der rekkefølgen identiteten mellom individer er så høyt som mulig, men sekvens identiteten mellom genet paralogs er så lavt som mulig. Vennligst se tilsvarende publikasjoner for bestemte primer-parene brukes for gene expression studier av Na+/K+ ATPase3 og aquaporins2 (figur 5).Merk: For dette formålet, RNA-seq sekvens data fra hundrevis av cyprids eller flere voksne kan brukes. Utforme primere for et gen som skal brukes for normalisering av uttrykk (f.eks, utgangen). Grunning brukt med hell i utgangen er fremover: 5′-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3′, og omvendt: 5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 “.Merk: Utgangen er et gen som brukte kontroll. Men har andre også blitt foreslått som en referanse og testet ut på barnacles19. Foruten begrepsordbok, bruk av RPL8, 36B4, EF1 og NADHd1 som en referanse er testet3. Det ble konkludert med at det er ingen store forskjeller i uttrykket nivåer av respektive referanse genene mellom soma, cirri, voksen eller cyprids. Optimalisere den annealing temperaturen for designet primerne legger til økende mengder cDNA (vanligvis i størrelsesorden 0,25-50 ng) i en blanding som inneholder SYBR Green, dNTP, utvalg og 0,3 µM hver av forover og bakover grunning. Kjøre qPCR-protokoller ved forskjellige annealing temperaturer som følger: en innledende rødsprit temperatur på 95 ° C i 3 minutter, et rødsprit skritt på 95 ° C for 20 s, annealing temperaturer på 55-63 ° C for 20 s, og en forlengelse ved 72 ° C for 30 s. Totalt kjøre 40 PCR sykluser.Merk: Primer-effektivitet skal ligge i området 90-105% og beregnes som E = (10^(-1/slope)-1) x 100 der stigningstallet er skråningen av kurven ved å plotte Logg verdien for de cDNA mot deres syklus-terskelverdier (Ct). Utføre qPCR ved hjelp av en passende mengde cDNA, vanligvis 1 – 10 ng, bruker PCR-protokollen som beskrevet i trinn 3 med optimal annealing temperaturen funnet.Merk: Høyere mengden cDNA brukes bare for gener som uttrykkes i svært små mengder.

Representative Results

Beskrives fremgangsmåten for dyrking av voksen barnacles av B. improvisus, opptil fire bunker med nauplius kan Larvene produseres per uke. Det ville være mulig å samle nauplius Larvene nesten hver kveld, men dette krever mer folk og infrastruktur (med mange barnacles i Ynglestammen, en kultur slipper Larvene kontinuerlig). En ytterligere begrensende faktor for Larvene produksjonen synes å være tilgjengeligheten av høy kvalitet, spesielt om slektene Skeletonema. Maksimalt, består hvert parti fra culturing systemet av omtrent 12 000 nauplii, opptil 50 000 nauplii per uke kan være kulturperler. Noen uker kan imidlertid opp til ti ganger færre Larvene produsert. En enkelt voksen kan produsere opptil 7000 Larvene per dag14, som betyr at 1-2 voksne lanserer Larvene for hvert parti. Innen en uke, vil ca 70-90% av de innsamlede nauplii utvikle seg til cyprids (gir omtrent 30.000 cyprids per uke, maksimalt) som kan brukes for utligning analyser og molekylære studier. Det bør understrekes at det er variasjoner i cyprid funksjoner mellom grupper, og det er generelt større variasjoner mellom batcher enn i kladder. For eksempel varierer bosetting suksessen i oppgjør analyser mellom 30 og 70% for forskjellige bunker. Dette er sannsynligvis forårsaket av personlige genetisk variasjon mellom bestemte par av voksne slippe larver i forskjellige prøveplanene perioder. Det, selvfølgelig, anbefales at gjentatte eksperimenter (biologiske gjentak) bør inkludere cyprids fra en rekke grupper hvis mer generelle uttalelser om resultatene skal gjøres. Parti til parti variasjonen setter krav på eksperimentell design, hvor riktig kontroller og normalizations i gene expression studier skal brukes. Men selv etter flere statistiske normalisering prosedyrer er implementert som betydelig redusere mellom satsvise variasjon, noen effekter av batchen er vanligvis fortsatt tydelig (upubliserte data). Etter den angitte protokollen, er det mulig å få, i gjennomsnitt 500 ng av høy kvalitet fra så lite som 20 cyprids, uavhengig av scenen av barnacle utligning (tabell 1). Kvaliteten på RNA måles vanligvis som forholdet mellom 18 år og 28S toppene (den forventede posisjonen av de to toppene er angitt i Figur 4). Men barnacles og mange andre leddyr, 28S rRNA bryter ned når oppvarmet (som en del av metoden analyse) og overfører sammen med 18S topp20. Det er derfor det er, i prinsippet, en enkelt rRNA topp i denne typen analyse for RUR. Det er klart fra denne testen (Figur 4) at en homogenisering av keramiske perler gir RNA med høyeste integritet og er derfor metoden for valg. RNA er tilstrekkelig mengde og kvalitet generere høy kvalitet sekvensering biblioteker for sekvensering, gir et gjennomsnitt av 70 millioner per prøve (antall leser, selvfølgelig, avhenger hvilket multipleksing under sekvensering). Mengden av RNA er også tilstrekkelig for cDNA syntese og qPCR uttrykk analyse av et stort antall gener. Figur 5 viser resultatet fra qPCR analyser av aquaporins og Na+/K+ ATPase (NAK1) skjøte varianter, der uttrykket endringer ble undersøkt i takt med endringer i miljømessige stikkordene2,3. En sammenligning av relativ uttrykket av langt og korte skjøte varianter av NAK1 viser en todelt øke for de lange NAK1 mRNA i lav saltholdighet i forhold til den korte NAK (figur 5et). Dermed indikerer data at alternativ skjøting gjør lang form dominerende under lav saltholdighet forhold. Når det gjelder aquaporins er det åpenbart at de to transport av vannet paralogs AQP1 og AQP2 vise differensial uttrykk (figur 5B). Spesielt mantelen vev er det tydelig at AQP1 er vesentlig ned-regulert på lavere salinitet, som ikke sett for AQP2. AQP2 viser i stedet en litt økt uttrykk på lavere salinitet, men i soma. Disse funnene gi en base for undersøkelser av funksjonelle rollene til de ulike B. improvisus ion transportører og aquaporins i barnacle osmoregulation. Figur 1 : Oversikt over hele dyrking prosedyren og RNA utvinning for gene expression studier hos voksne. For å starte en ny kultur, er paneler festet til en ramme og distribuert i havet på 1-3 m dyp. Etter flere uker, er paneler med voksne/barn plassert vertikalt i rack i skuffer i laboratoriet. Hvert brett inneholder 40 paneler med voksne. Med omtrent 100 voksne per panelet, i totale ≈ er 4000 voksne individer kultivert per skuff. De voksne barnacles fôres med Artemia og kan holdes året-rundt. Nauplius Larvene er samlet flere ganger per uke fra den skuffer via en filtrering gjennom en sil. De innsamlede nauplii overføres til bøtter holdt på 26 ° C i et vannbad og matet med mikroalger. Nauplii er oppdratt til de molt inn i ikke-mating cyprids, som er samlet inn ved filtrering. Nye paneler kan etableres i laboratoriet ved bosetting av cyprids på paneler, enten for å gi nye paneler for året-rundt kultur eller brukes til bestemte eksperimentelle oppsetninger med endrede eksterne forhold. RNA blir deretter Hentet fra barn/voksne på slutten av eksperimentet eller på bestemte tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2 : Bilder av noen viktige skritt i culturing prosedyren. (A) dette bildet viser rammene med paneler for å samle nye bestander fra feltet. (B) dette bildet viser paneler med voksen barnacles av B. improvisus i rack som er plassert i skuffer. Panelene er plassert ca 2 cm fra hverandre. (C) dette bildet viser skuffene med barnacle paneler og fôring tanken til venstre. Fra hver skuff er det en stikkontakt der sikter plasseres for innsamling av nauplius larver. (D) dette bildet viser produksjon av Artemia feed for de voksne RUR. (E) dette bildet viser oppdrett av nauplii i bøtter plassert i et vannbad satt til 26 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3 : Beskrivelse av de første Disseksjon av voksen barnacles: fjerne kroppen fra sitt skall. (A) ta en av opercular platene ved å sette tang forsiktig gjennom blenderåpning. Trekk forsiktig for å fjerne platen og utsette dyret. (B) trekk ut dyr ved å flytte den soma delen like nedenfor cirri. (C) dette panelet viser samlede anatomi av acorn RUR. Mantelen og potensielt befruktede egg (i eggstokken) bo i shell hulrom når kroppen trakk seg ut. Et notat på barnacle anatomi (for en mer detaljert konto, se Anderson)9: wall plater en barnacle skråningen innover, og sammen, de danner en vulkan-lignende kjegle. En åpning, blenderåpning, dekkes av de to opercular platene som danner en dør, eller bløtdyr, å lukke blenderåpning. Acorn barnacles generelt har en kalkholdig basale plate som er limt fast til undergrunnen; men mangler noen arter av barnacles denne kalkholdig platen (f.eks S. balanoides). Barnacles skiller exoskeleton fra gåte pigmentert mantelen (ryggskjoldet). Den ytre overflaten av dobbelt lag mantelen er forkalket for å bli stive, mens overflatebehandling av mantelen ikke er forkalket og er derfor fleksibel. Inne blenderåpning finnes cirri i en trukket inn posisjon. Dette er de thorax vedheng barnacles bruker for suspensjon fôring. Eggstokkene ligger nær bunnen av barnacle, mens testiklene ligger i soma. Dette tallet har blitt adoptert fra Panova et al. 21 og er publisert med tillatelse fra Springer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4 : Besluttsomhet rRNA integritet av kapillær gel geleelektroforese. RNA ble utarbeidet av to forskjellige homogenisering metoder: (A) sonication og (B) keramiske perler. Enheten på y-aksen, FU, står for fluorescens enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5 : Genuttrykk resultatene fra to forskjellige studier av gener som er viktig for osmoregulation i B. improvisus. (A) dette panelet viser differensial uttrykket målt ved qPCR skjøte varianter av Na+/K+ ATPase NAK1 svar på ulike salinitet og pCO2 nivåer3. I lav saltholdighet behandlingen, uttrykk for den lange isoformen (NAK1-L) er økt i forhold til korte (ANOVA, P < 0,001). (B) dette panelet viser uttrykk for aquaporins hos voksne av B. improvisus i sin eksponering for ulike salinitet2. qPCR ble brukt til å bestemme aquaporin uttrykk nivåene i forhold til utgangen. De voksne individene ble inkubert på 3 forskjellige salinitet (3, 20 og 33 PSU) i 14 dager. RNA forberedelse, ble soma, cirri og kappe av voksne skilt. I både tall angi feilfelt standardavviket. Den ** og *** indikerer nivået av betydningen (ANOVA), 0,01 og 0,001, henholdsvis. Disse tallene har blitt endret fra Lind et al. 2 , 3. både tall er publisert med tillatelse fra PLoS ONE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Bosetningen fase Totalbeløpet av RNA (ng) Kostnadsfri bading 512 Leting: Lukke søke 518 Tilknyttet cyprid 550 Nylig forvandlet juvenile 832 Tabell 1: gir av RNA. Denne tabellen viser RNA antallet utdraget med en RNA forberedelse kit fra bassenger av 20 cyprid personer samlet på ulike stadier under utligningsprosessen.

Discussion

Barnacle kultur på Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige) har kjørt over 20 år og har vært brukt i studier i mange forskjellige forskningsområder. Over 30 vitenskapelige artikler har blitt publisert som har benyttet culturing systemet under de siste årene, inkludert studier i antifouling13,22, hydrodynamikk23, kjemiske økologi24, klimaendringer16 , evolusjonsbiologi5og molekylærbiologi2.

For å unngå valg av visse personer som er mer tilpasset laboratoriemiljø (personer som ikke er representative for befolkningen ville), anbefales det å samle en ny stamfisk fra feltet hvert år. Dessuten, er det også lurt å forynge kulturen årlig, siden det er omtrent 50-80% av dødelighet hos voksne under et normalår. Hvis målet er å produsere innavlet linjer eller definere studier av eksperimentelle evolusjon, er det imidlertid bare laboratorium-bakside familier skal brukes.

En god tid å samle B. improvisus på panelene Tjärnö Marine forskningslaboratoriet er i juni-August fordi på den tiden, det er en god tilførsel av cyprid larver i havet. Sjekk panelene ukentlig se når barnacle bosetningen starter og manuelt fjerne andre avgjort arter enn B. improvisus (f.eks, blåskjell, kappedyr, bryozoans, hydroids, nemerteans/tubeworms og andre barnacle arter) fra den paneler (f.eksmed en tannbørste). Rundt Tjärnö er det tre grunt vann barnacle arter til stede (B. improvisus, Semibalanus balanoidesog Balanus crenatus). B. improvisus er imidlertid dominerende fouler glatt harde flater i juli-August. S. balanoides har sin utligningsperioden begynnelsen våren og foretrekker hovedsakelig naturlige underlag (f.eks, steiner). B. crenatus kan forekomme på lave tall på panelene i løpet av sommeren.

Det er også mulig å starte nye voksen barnacle generasjoner kulturperler cyprids, som ville være nødvendig hvis visse linages med spesifikke egenskaper er etablert, eller i studier av eksperimentelle evolusjon. Den mest praktiske måten å starte nye generasjoner av voksne er å bosette cyprids på termoplastisk paneler i laboratoriet. Disse panelene med nylig utlignet cyprids kan også brukes i eksperimentell behandlinger eller eksponering i feltet. I nødsituasjoner kan man også bruke voksne på blokker fra et nærliggende område (f.eksIdefjorden ved Tjärnö Marine Research Laboratory) der B. improvisus er vanlig. Disse allerede etablerte voksne er behandlet på samme måte som voksne på panelene, dermed blir plassert i skuffer og matet via gjennomflytsenhet systemet. Flyt celler kan også brukes til å opprette paneler med rur25. Dette er gjennomflytsenhet kamre med plankton netto på sidene som cyprids ikke slå, med paneler som eneste for larvene.

Det er flere trinn som er kritiske for å sette opp en langsiktig fungerende barnacle kultur inkludert alle livsstadier. Metodene som brukes til kultur B. improvisus er sannsynligvis, i stor grad, gjelder også for andre marine dyr med frittlevende, planktotrophic larver. Dyrking prosedyrer for noen arter er allerede godt beskrevet (f.eksfor blå blåskjell og ulike arter av østers)26, mens for andre marine dyr, det er bare noen eksempler på langsiktige kulturer som spenner over hele livet syklus. En av de første vellykkede forsøkene på å kultur rur (B. amphitrite) ble gjort av Rittschof et al. 15. langsiktige økonomiske og personlige ressurser bør være på plass før du vurderer å sette opp en barnacle dyrking anlegget. Vedlikehold av denne typen året-rundt barnacle kultur krever minst én person arbeider halv tid. Det kan være noen potensielle fremtidige automatisering av noen trinn i produksjonslinjen, hovedsakelig dyrking av mikroalger27. I tillegg for å lykkes, er det viktig å ha tilgang til store mengder av høy kvalitet sjøvann. Dyrking av mikroalger, Artemia, og barnacles innebærer ikke noen bestemt sikkerhetsrutiner. Men må tester av noen antifouling stoffer eller giftige kjemikalier forsiktighetsregler.

Panelene ble sjekket flere ganger i uken for forurensing. Sjøvannet i kulturen ble pumpet fra 40 m dyp i Kosterfjorden utenfor Tjärnö Marine Research Laboratory og gikk gjennom to sand filtre før lab vannsystemet. Hvis ingen filtrering av vannet hadde blitt gjort, ville det være mye mer forurensning i kulturen. Det er viktig å regelmessig vaske panelene i kulturen fra detritus og andre dyr (f.eksstolon-bygningen hydroids og ROV nemerteans) angir systemet gjennom tilførsel av sjøvann fra feltet. For eksempel hvis ingen Larvene produseres til tross for at kultur har vært velfødde og ellers synes å være i god stand, problemet skyldes tilstedeværelse av nemerteans som synes å hemme parring. Naturligvis, mange av de skadelige organismene i kulturen på Tjärnö Marine forskningslaboratoriet var spesifikke for Sveriges vestkyst, og andre typer forurensende organismer vil være utbredt og være mer av en utfordring i andre geografiske områder. På vestkysten av Sverige er det uvanlig å finne forurensning av andre barnacle arter på panelene. Noen ganger, etablering av S. balanoides har blitt funnet, men dette er et marginale problem (mest, en S. balanoides miljøgifter for 10.000 B. improvisus prøver). Mangel på forurensende arter var sannsynligvis avhengig regimet å etablere nye kulturer om sommeren når larvaefrom B. improvisus var svært dominerende. I tillegg var det også en klar anriking av B. improvisus på panelene siden denne arten er selektiv for glatte flater13.

Det er viktig å fjerne død voksen RUR. Hvis de tomme skallene igjen på panelene, kan de bli en ly både for Artemia nauplii og ulike forurensende arter. I tillegg har det blitt konstatert at døde individer innflytelse trivsel i nabolandet individer, sannsynligvis med utgivelsen av giftige stoffer i nedbryting. En ytterligere konsekvens av voksen dødelighet er at noen personer vil stå alene og for langt fra noen andre voksne tillate mating (selv om barnacles har lengste penis i dyr verden i forhold til størrelsen)28. Disse personene vil overleve, men er ikke-produktive for larver. Men disse ensomme voksne individer kan forsiktig fjernes uten å skade base-platen og plasseres horisontalt nær andre aktivere parring. Barnacles kan også bli parret ved å plassere paneler med en voksen på hver, men nært nok slik at cross-fertilization kan oppstå. På denne måten kan genetisk linjer være produsert14.

Det er viktig å produsere en innmating av høy kvalitet og å mate kulturer nesten hver dag. Et par dager uten mat kan resultere i en mindre versjon av larver. Tidligere tester av kosthold sammensetning har vist at Kiselalger er avgjørende for vekst og overlevelse av barnacle nauplii. Flere slektene arter synes tilstrekkelig som fôr, selv om små eller enslig celler (mindre enn 10 µm i diameter) kan være nødvendig for de nauplii inntak. Arten S. marinoiog C. simplex T. pseudonana har alle vist seg for å være tilstrekkelig feed for B. improvisus nauplii, og lett å dyrke. I tillegg er feed kvaliteten generelt høyere for eksponensielt voksende alger. Det er også rapportert at Kiselalger er avgjørende for å etablere produktiv kulturer B. amphitrite15. En teori om viktigheten av Kiselalger er at de har en unik fatty acid-profil og er spesielt rik på svært flerumettet 20:5 fettsyrer29. Det har vist at visse fettsyrer er viktige for den vellykkede utviklingen av østers Larvene30.

Gjennom årene har det vært ingen forekomst av ødeleggende sykdommer i barnacle kultur. I mange kommersielle virvelløse aquacultures, som østers og muslinger, sykdommer er ganske vanlig og kan være svært skadelig. Skadelige effekter av virus har også blitt rapportert fra ville populasjoner. Native østers i Frankrike ble erstattet av portugisisk østers Crassostrea angulata i 1925, men denne arten ble utryddet av en iridovirus rundt 197031. Nylig har det vært massiv dødelighet hendelser i Pacific østers Crassostrea gigas i kulturer over hele verden, som synes å være forbundet med ostreid herpesvirus 132. Ingen rapporter om patogener, bakterier eller virus med rur har blitt publisert så langt. Men i pågående genom-prosjektet på B. improvisus, virus sekvenser ble funnet (Alm Rosenblad et al., upubliserte data) men med ingen åpenbar link til symptomer av sykdommer. Blandinger av antibiotika er tidligere brukt kulturer å minimere risikoen for bakterielle infeksjoner; denne fremgangsmåten er nå forlatt, og så langt har dette ikke ført forurensning problemer.

Hvis sjøvann varmes opp (som beskrevet ovenfor), kan overoppheting være den mest alvorlige risikoen i produksjonslinjen kultur. Det er selvfølgelig vanskelig å beskytte mot overoppheting, selv om sensorer og riktig varsling systemer kan være brukt (f.eks, sende e-post eller tekstmeldinger til ansvarlige personer). Hendelser av denne typen i siste har resultert i betydelige drap voksne i kulturen. Dette kan selvfølgelig være ødeleggende og ødelegge langsiktige investeringer av tid og penger. Spesielt vil dette være katastrofale hvis innavlet genetisk linjer er etablert. For å sikre lang av slike linjer og sikre dem mot utilsiktet tap, ville det være ønskelig å utvikle en kryonisk bevaring metodikk for RUR. Det har blitt rapportert at larvene fra Pacific østers kan være frosset ned og gjenopplivet med delvis suksess33. Cryobanking har også vært et verdifullt verktøy for å bevare de genetiske ressursene for en rekke arter34. Selv nauplii fra B. amphitrite rapporteres å overleve frysing35, og det ble funnet at 20% frosset ned personer ble forvandlet til cyprids36. Søknad fryser for den langsiktige bærekraften i kulturer har så langt ikke blitt adoptert, men dette vil faktisk være nødvendig for vedlikehold av valgte linjer; Dette vil være et viktig skritt å etablere fast B. improvisus i en potent marine modelsystem.

Her, ble en protokoll presentert for Disseksjon av ulike vev fra voksne av B. improvisus (dvs., cirri, soma og mantel). Det må imidlertid understrekes at andre vev kan også være hentet. For eksempel er bløtvev mellom ytre og indre mantelen av membranous-base arten Tetraclita japonica formosana nøye isolert og en RNA utvinning og RNA-seq analyse av gene expression37. Skissert optimalisert utvinning protokollen beskrevet her gir tilstrekkelige mengder av høy kvalitet for sekvenser fra en minimal mengde starter materiale. Først minimerer innsamling av personlige Larvene direkte inn i homogenisering rørene tap under overføringen fra en tube til en annen. Videre testet blant de forskjellige metodene, homogenisering med keramiske perler viste seg for å være den mest effektive i RNA gi og integritet, sammenlignet med sonication eller støter homogenisering. Når du planlegger genuttrykk eller genomics eksperimenter, må man huske på utfordringen med høy genetisk variasjon i RUR, minst for B. improvisus. Barnacle har en genetisk mangfold i området 3-5%, selv i koding regioner (Alm Rosenblad et al., upubliserte data). Dette, selvfølgelig, legger spesifikke krav på design av primer for qPCR analyse, der mer bevart områder bør identifiseres og brukes som maler for primere for å få konsekvent uttrykk resultatene betweenbatches. Konserverte områder for målet gener, som aquaporins og Na / K + ATPases, kan identifiseres ved å studere sekvens variasjon av disse genene i RNA-seq data fra populasjoner av cyprids som inneholder hundrevis av personer. For en genomet analyse, vil DNA prøves. Imidlertid kan få høykvalitets DNA fra B. improvisus være utfordrende21.

Avslutningsvis etablerte barnacle kulturen har vist seg for å være medvirkende i forskjellige eksperimentelle studier. Spesielt all-året-rundt larver produksjonen tillater oss å utføre eksperimenter uten tilværelse begrenset til naturlig forekommende gyting perioden (for B. improvisus, dette er om sommeren). Innhentet Larvene kan brukes til å utføre et bredt sett av eksperimentelle studier, inkludert oppgjør analyser, atferd analyser, uttrykk studier på bestemte gener, samt genomet hele transcriptome studier.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av stipend 2017-04559 fra svenske Research Council (VR) og EU støttet prosjektet STRANDPROMENADEN til Anders Blomberg. Spesielt etableringen av culturing anlegget har gjennom årene blitt støttet av tilskudd til Per R. Jonsson fra de følgende virkemiddelaktører: SSF (svensk Foundation til strategisk forskning) gjennom programmet Marin vitenskap og teknologi og MISTRA gjennom programmet maritim maling. Kent Berntsson var medvirkende i de tidlige fasene av culturingfacility. Ytterligere finansiering for å etablere culturing anlegget har kommet fra sentrum for Marine evolusjonsbiologi (www.cemeb.science.gu.se), som er støttet av Linnaeus stipend fra svenske forskningsråd FORMAS og VR.

Materials

Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels Plastic produkter, Bromma, Sweden transparent glas
1.5-L PET bottle
Artemia INVE Aquaculture, Belgium We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1085/3
Millipore cartridge filter system Millipore 
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm Millipore  cartridge CWSS01S03 High capacity for large volumes
polycarbonate bottle Nalgene autoclavable
RNA later Qiagen 76106  Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit Invitrogen/Thermofisher Scientific   AM1907 DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit Biorad 1708890 cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix Biorad 1708880 Dye for QPCR
RNeasy minikit Qiagen 74104 RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes Precellys KT03961-1-003.2 Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit Qiagen 74004 RNA extraction of few cyprids
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Darwin, C. . A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , (1854).
  2. Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
  3. Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
  4. Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
  5. Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
  6. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
  7. Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
  8. Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
  9. Anderson, D. T. . Barnacles – structure, function, development and evolution. , (1994).
  10. Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
  11. Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
  12. Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
  13. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
  14. Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
  15. Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
  16. Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
  17. Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. , 22-60 (1975).
  18. Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
  19. Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
  20. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
  21. Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
  22. Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
  23. Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
  24. Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
  25. Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
  26. Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
  27. Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
  28. Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
  29. Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
  30. Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -. &. #. 1. 9. 7. ;. Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
  31. Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l’Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
  32. Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
  33. Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
  34. Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
  35. Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
  36. Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
  37. Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).

Tags

Barnacle Balanus ImprovisusMarine Model OrganismCulturingGene ExpressionLarval EcologyBiofoulingEvolutionary BiologyReceptor-ligand InteractionsAntifouling TechnologiesOsmoregulationRobust ReproductionShort Generation TimeSeawater SupplyFeed ProductionPanel DeploymentJuvenile GrowthSkeletonema MarinoiArtemia Nauplii

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Jonsson, P. R., Wrange, A., Lind, U., Abramova, A., Ogemark, M., Blomberg, A. The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model – Culturing and Gene Expression. J. Vis. Exp. (138), e57825, doi:10.3791/57825 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image