Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans
Summary
Vi beskriver en modificeret små udvinding og kolorimetriske assays af laktat og pyruvat i fyrretræsnematoden C. elegans. Når udnytte kommerciel assay kits, er den tekniske udvikling af deres følsomhed og nøjagtighed vigtige. Protein nedbør i udvinding er det mest afgørende skridt for kvantitativ bestemmelse af intracellulære metabolitter.
Abstract
Laktat og pyruvat er centrale mellemprodukter af intracellulære energi stofskifteveje. Overvågning laktat/pyruvat forholdet i celler hjælper med at afgøre, om der er en ubalance i aldersrelaterede energimetabolisme mellem mitokondriel oxidativ fosforylering og aerob glykolyse. Her, viser vi udnyttelsen af kommercielle kolorimetriske assay kits til laktat og pyruvat i model organisme C. elegans. For nylig, følsomhed og nøjagtighed af de kolorimetriske/fluorimetri assay kits er blevet forbedret betydeligt de forsknings-og udført af reagens producenter. De forbedrede reagenser har aktiveret brug af små assays med 96 brønde plade i C. elegans. Generelt er en fluorimetri assay overlegen i følsomhed til en kolorimetrisk assay; men den kolorimetriske metode er mere velegnet til brug i almindelige laboratorier. Et andet vigtigt emne i disse assays til kvantitativ bestemmelse er protein udfældning af homogeniseret C. elegans prøver. I vores protein nedbør metode, fælles precipitants (fx., trichloreddikesyre, perchlorsyre og metaphosphoric syre) bruges til forberedelse af prøver. Et protein-fri assay prøven er udarbejdet af direkte tilføje kolde fældningsmiddel (endelig koncentration på 5%) i løbet af homogenisering.
Introduction
Laktat og pyruvat koncentrationer er bredt anerkendt som mellemprodukter af energimetabolisme, og er relateret til stater af glykolyse, tricarboxylic syre (TCA) cyklus og elektron transportkæde i cellerne i aerobe organismer. En serie af reaktionerne i glykolysen oxidere glukose til pyruvat, der ligger ved en metabolisk korsvej og kan konverteres til kulhydrater gennem glukoneogenese, fedtsyrer og energimetabolisme gennem acetyl-CoA og aminosyre alanin. TCA cyklus opstår under tilstedeværelsen af tilstrækkelig opløst ilt og er grundlæggende for konvertering af glukose til energi. Især, ændring af sekundære metabolisme er et interessant fænomen som glykolyse bruges overvejende til energiproduktion og aerob mitokondrie respiration, som omfatter TCA cyklus og elektron transportkæde, er downregulated i pattedyr kræft celler1,2. Vi viste for nylig at laktat niveauer og det deraf følgende laktat/pyruvat (L/P) forholdet faldt under aldring i model organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans). Vi fandt ligeledes, at pattedyr tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 i C. elegans har en vigtig rolle i de aldersrelaterede ændringer af energimetabolisme gennem aktivering af sin transcriptional mål3.
I biologiske assays, såsom måling af laktat og pyruvat koncentrationer i celler, har følsomhed, nøjagtighed, samplingstørrelse og inkubationstiden for kolorimetriske/fluorimetri assay kits forbedret dramatisk. På grund af teknologiske innovationer er vi nu i stand til at analysere forskellige metabolitter og mellemliggende metabolitter uden den store kultur af C. elegans, som er vanskeligt givet sin lille størrelse. Følsomheden af en kolorimetrisk assay er generelt en størrelsesorden mindre end for en fluorimetri assay; den kolorimetriske metode er dog mere egnet i fastsættelsen af fælles laboratorier. Derudover er en udvinding teknik indeholdende homogenisering og protein nedbør afgørende for kvantitativ bestemmelse af laktat og pyruvat koncentrationer i C. elegans celler, fordi denne nematode er omsluttet af en exoskeleton kaldet neglebånd, i modsætning til pattedyr kulturperler celle linjer4,5. Her, beskriver vi en protokol for at analysere laktat og pyruvat koncentrationer ved hjælp af kommercielle kolorimetriske assay kits herunder tips til prøven udvinding fra C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når man bruger disse kolorimetriske assay kits, er den mest afgørende skridt i stikprøven udvinding til at opdage cellulære laktat og pyruvat præcist i C. elegans processen med protein nedbør i løbet af homogenisering (figur 1). Det er ikke strengt nødvendigt at bruge en Teflon homogeniseringsapparat, som andre homogenizers (fx., Dounce, og tilspidset væv vinkelslibere eller perle mills) er også velegnet til små udvinding af orme. Vi gjorde ikke opdager cellulær…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev økonomisk støttet af en særlig forskning tilskud fra Daito Bunka Universitet til Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
Referenzen
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
