छोटे पैमाने पर वर्णमिति की परख Intracellular स्तनपान और पाइरूवेट में निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस
Summary
हम एक संशोधित छोटे पैमाने पर निष्कर्षण और निमेटोड सी एलिगेंस में स्तनपान और पाइरूवेट की वर्णमिति परख का वर्णन । जब वाणिज्यिक परख किट, उनकी संवेदनशीलता और सटीकता के तकनीकी विकास का उपयोग महत्वपूर्ण है । निष्कर्षण में प्रोटीन वर्षा intracellular चयापचयों के मात्रात्मक निर्धारण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है ।
Abstract
स्तनपान और पाइरूवेट intracellular ऊर्जा चयापचय रास्ते के प्रमुख मध्यवर्ती हैं । कोशिकाओं में स्तनपान/पाइरूवेट अनुपात की निगरानी यह निर्धारित करने में मदद करता है कि क्या mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण और एरोबिक glycolysis के बीच उम्र-संबंधित ऊर्जा चयापचय में असंतुलन है । यहां, हम मॉडल जीव सी एलिगेंसमें स्तनपान और पाइरूवेट के लिए वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का उपयोग दिखा । हाल ही में, संवेदनशीलता और वर्णमिति/fluorimetric परख किट की सटीकता बहुत अनुसंधान और एजेंट निर्माताओं द्वारा किए गए विकास द्वारा सुधार किया गया है । सुधार रिएजेंट एक ९६- सी एलिगेंसमें अच्छी तरह से प्लेट के साथ छोटे पैमाने पर परख के उपयोग सक्षम है । सामांय में, एक fluorimetric परख एक वर्णमिति परख के लिए संवेदनशीलता में बेहतर है; तथापि, वर्णमिति दृष्टिकोण आम प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए अधिक उपयुक्त है । मात्रात्मक निर्धारण के लिए इन परख में एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा homogenized सी एलिगेंस नमूनों की प्रोटीन वर्षण है । हमारे प्रोटीन वर्षण विधि में, आम precipitants (जैसे, trichloroacetic एसिड, perchloric एसिड और metaphosphoric एसिड) नमूना तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है । एक प्रोटीन मुक्त परख नमूना सीधे शीत precipitant (5%) के homogenization के दौरान अंतिम एकाग्रता जोड़ने के द्वारा तैयार किया जाता है ।
Introduction
स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता व्यापक रूप से ऊर्जा चयापचय के मध्यवर्ती के रूप में माना जाता है, और glycolysis, tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र, और एरोबिक जीवों की कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के राज्यों से संबंधित हैं । पाइरूवेट के लिए glycolysis ऑक्सीकरण ग्लूकोज में प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला है, जो एक चयापचय चौराहे पर निहित है और gluconeogenesis के माध्यम से कार्बोहाइड्रेट के लिए परिवर्तित किया जा सकता, फैटी एसिड और ऊर्जा चयापचय के माध्यम से एसिटाइल-CoA, और एमिनो एसिड alanine के लिए. टीसीए चक्र पर्याप्त भंग ऑक्सीजन की उपस्थिति के तहत होता है और ग्लूकोज के लिए ऊर्जा के रूपांतरण के लिए मौलिक है. विशेष रूप से, माध्यमिक चयापचय के परिवर्तन एक दिलचस्प घटना है जिसमें glycolysis ऊर्जा उत्पादन और एरोबिक mitochondrial श्वसन, जो टीसीए चक्र और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला शामिल है के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया जाता है, downregulated है स्तनधारी कैंसर कोशिकाओं में1,2. हम हाल ही में पता चला कि स्तनपान का स्तर और फलस्वरूप स्तनपान/पाइरूवेट (एल/पी) मॉडल जीव Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) में उंर बढ़ने के दौरान अनुपात में कमी आई । इसी तरह हमने पाया कि स्तनधारी ट्यूमर शमनकर्ता p53 ortholog वयक-१ में सी. एलिगेंस ने अपने transcriptional लक्ष्य३के सक्रियण के माध्यम से ऊर्जा चयापचय के आयु संबंधी बदलावों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है.
जैविक परख में, ऐसे स्तनपान और कोशिकाओं में पाइरूवेट सांद्रता की माप के रूप में, संवेदनशीलता, सटीकता, नमूना आकार, और वर्णमिति/fluorimetric परख किट की मशीन समय नाटकीय रूप से सुधार किया गया है । प्रौद्योगिकीय नवाचारों के कारण अब हम सी. एलिगेंसकी बड़े पैमाने पर संस्कृति के बिना विभिन्न चयापचयों और मध्यवर्ती चयापचयों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं, जो अपने छोटे आकार दिया मुश्किल है । सामांय में, एक वर्णमिति परख की संवेदनशीलता एक fluorimetric परख की तुलना में छोटे परिमाण के एक आदेश है; हालांकि, वर्णमिति दृष्टिकोण आम प्रयोगशालाओं की सेटिंग में अधिक उपयुक्त है । इसके अलावा, एक निष्कर्षण homogenization और प्रोटीन वर्षा युक्त तकनीक सी. एलिगेंस कोशिकाओं में स्तनपान और पाइरूवेट सांद्रता के मात्रात्मक निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह निमेटोड एक exoskeleton में संलग्न है छल्ली बुलाया, स्तनधारी के विपरीत प्रसंस्कृत सेल लाइनों4,5। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए स्तनपान और पाइरूवेट सी एलिगेंससे नमूना निष्कर्षण के लिए सुझावों सहित वाणिज्यिक वर्णमिति परख किट का उपयोग कर सांद्रता का विश्लेषण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
जब इन वर्णमिति परख किट, नमूना निष्कर्षण में सबसे महत्वपूर्ण कदम के उपयोग के लिए सेलुलर स्तनपान और पाइरूवेट सही में सी. एलिगेंस में homogenization के दौरान प्रोटीन वर्षण की प्रक्रिया है (चित्रा 1) । ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आर्थिक रूप से Daito Bunka विश्वविद्यालय से Sumino Yanase के लिए एक विशेष अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
Referenzen
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