Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

La hipófisis es un órgano endocrino clave en vertebrados situados debajo del hipotálamo y posteriores al quiasma óptico. Produce y secreta hormonas de seis a ocho de los tipos celulares específicos. Hormonas hipofisarias constituyen un intermedio entre el cerebro y los órganos periféricos y manejar una amplia gama de procesos fisiológicos esenciales, incluyendo el crecimiento, la reproducción y la regulación de la homeostasis. Similar a las neuronas, las células endocrinas de la hipófisis son eléctricamente excitables con capacidad para disparar potenciales de acción espontáneamente ¹. El papel de estos potenciales de acción es dependiente de la célula. En varios tipos celulares de la hipófisis mamífero, potenciales de acción pueden elevar el Ca intracelular^{2 +} suficientemente para una liberación sostenida de hormonas ². Además, la hipófisis recibe información tanto estimulante como inhibitoria en el cerebro que afecta el potencial de membrana de las células ^3,4,5,6. Por lo general, entrada estimulante aumenta la excitabilidad y a menudo implica la liberación de Ca^{2 +} de los almacenes intracelulares así como mayor frecuencia ⁷de disparo. Entendimiento de cómo la célula utiliza la composición de la canal de ion y se adapta a estas señales de entrada en el cerebro es clave para la síntesis de la hormona de comprensión y liberación.

La técnica de patch-clamp fue desarrollada a finales de 1970 por Sakmann y Neher ^8,9,10 y mejorada por Hamill ¹¹y permite investigaciones detalladas de las propiedades electrofisiológicas de las células hasta canales de iones individuales. Por otra parte, la técnica puede utilizarse para el estudio de corriente y voltaje. Hoy en día, parche-es el estándar de oro para la medición de las propiedades electrofisiológicas de la célula. Cuatro configuraciones principales de la técnica de patch-clamp de cierre hermético han sido desarrollado ¹¹; la célula adjunta, dentro, la exterior y el parche de células completas. Las tres primeras configuraciones se utilizan típicamente para las investigaciones de canal de iones individuales. Para el cuarto, después de la configuración de conexión de celda, un agujero en la membrana celular se realiza mediante presión sub-atmosférica. Esta configuración también permite que las investigaciones de la composición de la canal de ion de la célula entera ¹². Sin embargo, una limitación de esta técnica es que moléculas citoplásmicas se diluyen por el parche pipeta solución ¹³ (figura 1A), pues afecta las respuestas eléctricas y fisiológicas de las células estudiadas. De hecho, algunas de esas moléculas pueden jugar papeles importantes en la transducción de la señal o en la regulación de canales iónicos diferentes. Para evitar esto, Lindau y Fernandez ¹⁴ desarrolló un método donde se agrega un compuesto formando poros a la pipeta del parche. Tras la configuración de conexión de celular, el compuesto se incorporan en la membrana de plasma bajo el parche y lentamente perfore la membrana creando contacto eléctrico con el citosol (figura 1B). Pueden utilizar varios diferentes antifúngicos como la nistatina y la anfotericina B ^{15 16}o surfactantes como la saponina beta-escina ^17,18 . Estos compuestos crean poros lo suficientemente grandes como para permitir que los cationes monovalentes y Cl^– difusión entre el citosol y la pipeta patch conservando los niveles citosólicas de macromoléculas y los iones más grandes como Ca^{2 + 15, 16}.

El reto de usar parche perforado es la resistencia serie potencialmente alto. Resistencia en serie (R_s) o acceso de resistencia es la resistencia combinada sobre la pipeta patch concerniente a la tierra. Durante las grabaciones de la abrazadera del remiendo, R_s estará en paralelo con la resistencia de la membrana (R_m). R_m y R_s en trabajo paralelo como un divisor de tensión. Con la alta R_s, la tensión caerá sobre la R_s dando errores en las grabaciones. El error será mayor con las corrientes más grandes registradas. Además, el divisor del voltaje también es frecuencia dependiente creando un filtro de paso bajo, afectando así a la resolución temporal. En efecto, el parche perforado no siempre permiten grabaciones de grandes y rápidas corrientes como el voltaje bloqueado las corrientes Na⁺ (para lecturas detalladas ver referencia ¹⁹). También, R_s puede variar durante la grabaciones de la abrazadera del remiendo, otra vez conduce a cambios en la corriente registrada. Así, pueden ocurrir falsos positivos en situaciones donde R_s cambia durante el uso de la droga.

La electrofisiología en el tejido en rodajas se introdujo por el laboratorio de Andersen para estudiar características electrofisiológicas de las neuronas en el cerebro de ²⁰. La técnica allanó el camino para investigaciones detalladas de las células así como circuitos comunicaciones y celular de la célula en un ambiente más intacto. Una técnica similar para hacer rebanadas de hipófisis fue introducida en 1998 por Guérineau et al. ²¹. sin embargo, no fue antes de 2005, que la preparación de corte de cerebro-pituitaria fue utilizada con éxito para estudios de patch-clamp en teleósteos ²². En este estudio, los autores también informaron el uso de grabaciones de la abrazadera del remiendo perforada. Sin embargo, en gran medida, la mayoría de las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias se han realizado en mamíferos y sólo un puñado de otros vertebrados, incluyendo peces teleósteos ^1,2,22,23 . En teleósteos, casi todos los estudios fueron realizados en las células disociadas primarias ^{24,25,26,27,28,29,30} .

En el presente artículo, esbozamos un protocolo optimizado para la preparación de saludables rebanadas de cerebro-pituitaria de la medaka de pescado modelo. El enfoque representa varias ventajas en comparación con cultivos primarios de células disociadas. En primer lugar, las células se guardan en un medio ambiente relativamente preservado frente a disociarse de las condiciones de cultivo celular. En segundo lugar, preparaciones de corte nos permiten estudiar vías indirectas mediadas por célula comunicación ²², que no es posible en condiciones de cultivo de células disociadas. Además, demostramos cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas en los cortes de tejido obtenidos usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo con la anfotericina B como agente de formación de poro.

Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, se encuentran principalmente en Japón. La fisiología, la embriología y la genética de medaka se ha estudiado ampliamente por más de 100 años ³¹, y es un modelo de investigación utilizado en muchos laboratorios. De particular importancia para este trabajo es la distinta organización morfológica del complejo hipotálamo-hipofisario en los peces teleósteos: mientras que en mamíferos y aves las neuronas hipotalámicas suelte sus neuro-las hormonas que regulan las células endocrinas hipófisis en el sistema del portal de la eminencia media, hay una directa proyección nerviosa de las neuronas hipotalámicas en las células endocrinas de la hipófisis en los peces teleósteos ³². Así, cortar cuidadosamente realizados de cerebro-pituitaria es de particular importancia en los peces, lo que nos permite investigar características electrofisiológicas de las células hipofisarias en una bien conservada red de cerebro-pituitaria y las células de la pituitarias en particular cómo control de la excitabilidad y de tal modo homeostasis de Ca^{2 +} .