Sağlıklı beyin hipofiz dilimleri Teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar için
Summary
Hipofiz hücreleri ile yama-klemp tekniği kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar ardından kalıcı beyin hipofiz doku dilimleri, teleost balık medaka (Oryzias latipes), kullanarak yapmak için en iyi duruma getirilmiş bir protokol makalede delikli yama yapılandırma.
Abstract
Çok sayıda omurgalı tür, ama çok az teleost balık hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar yapılmıştır. Bunlar arasında açık çoğunluk Disosiye primer hücre gerçekleştirdiniz. Daha biyolojik ilgili bir ortamda davranır, nasıl teleost hipofiz hücreleri anlayışımızı geliştirmek için bu protokol küçük tatlı su balığı medaka (Oryzias latipes) kullanarak kalıcı beyin hipofiz dilimleri hazırlamak gösterilmiştir. Beyin hipofiz dilimleri yapma, pH ve tüm çözümleri osmolalite vücut sıvıları 25-28 ° C’de yaşayan tatlı su balık içinde bulunan değerleri için ayarlandı Dilim hazırlık protokol elektrofizyolojik kayıtlar delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği kullanarak yapmak gösterilmiştir. Yama-klemp tekniği benzeri görülmemiş zamansal çözünürlük ve hassasiyet, soruşturma tek iyon kanalları aşağı olduğu gibi tüm hücrelerden elektriksel özellikleri sağlayan güçlü bir araçtır. Delikli yama yama pipet elektrot çözüm tarafından seyreltilmiş sitozol düzenleyici elemanlarının bozulmadan önleme hücre içi çevre tutar benzersizdir. Buna ek olarak, geleneksel bütün hücreli kayıtları yapılırken, bu medaka hipofiz hücreleri hızlı bir şekilde Aksiyon potansiyelleri ateş yeteneklerini kaybedecekler gözlendi. Çeşitli perforasyon teknikleri arasında bu iletişim kuralını perforasyon Amfoterisin B. mantar ilacı kullanma yamalı membran ulaşmak gösterilmiştir
Introduction
Hipofiz omurgalılarda hipotalamus aşağıda yer alan ve posterior optik hemisferlerine için anahtar bir endokrin organdır. Bu üretir ve altı ya da sekiz hormonlar belirli hücre türleri salgılar. Hipofiz hormonları beyin ve periferik organlarda arasında bir ara oluşturmaktadır ve temel fizyolojik süreçleri büyüme, üreme ve homeostasis düzenlenmesi de dahil olmak üzere geniş bir sürücü. Nöronlar, hipofiz endokrin hücreleri benzeri elektrikle heyecanlı aksiyon potansiyelleri kendiliğinden ateş yeteneği ile 1. Bu aksiyon potansiyelleri hücre bağımlı roldür. Birkaç hücre tür memeli hipofiz, Aksiyon potansiyelleri intrasellüler Ca2 + hormon 2sürekli bir sürümü için yeteri kadar yükseltebilir. Buna ek olarak, hipofiz hücreleri 3,4,5,6membran potansiyelini etkileyen beyin uyarıcı ve inhibitör bilgilerini alır. Genellikle, uyarıcı giriş uyarılabilirlik artırır ve sık sık açıklaması, Ca2 + hücre içi mağaza içerir yanı sıra frekans 7ateş arttı. Nasıl hücre iyon kanal kompozisyon kullanır ve bu giriş sinyalleri beyinden adapte anlayış hormon sentezi ve serbest bırakmak için anahtardır.
Yama-klemp tekniği 1970’lerin sonunda Sakmann ve Neher 8,9,10 tarafından geliştirilen ve Hamill 11tarafından daha da geliştirilmiş ve ayrıntılı araştırmalar hücrelerin elektrofizyolojik özellikleri sağlar tek iyon kanalları aşağı. Ayrıca, teknik akım ve gerilim eğitim için kullanılabilir. Bugün, yama sıkma elektrofizyolojik hücre özelliklerini ölçmek için altın standart ‘s. Dört büyük yapılandırmaları sıkı mühür yama-klemp tekniği, Gelişmiş 11gelmiş; hücre bağlı, Inside out, dış-out ve bütün hücreli yama. Üç ilk yapılandırmasından genellikle tek iyon kanal araştırmalar için kullanılır. Hücre bağlı yapılandırma aşağıdaki 4 Temmuz’da, hücre zarının delik alt atmosferik basınç kullanılarak yapılır. Bu yapılandırma aynı zamanda araştırmalar iyon kanal kompozisyon tüm cep telefonu 12sağlar. Ancak, bir bu teknik sitoplazmik molekülleri böylece okudu hücrelerinin elektrik ve fizyolojik tepkileri etkileyen yama pipet çözüm 13 tarafından (Şekil 1A), seyreltilmiş kısıtlamasıdır. Nitekim, bazı bu moleküller sinyal iletim veya farklı iyon kanalları düzenlenmesi önemli rol oynayabilir. Bunu önlemek için bir gözenek oluşturmayan bileşik yama pipet eklendiği Lindau ve Fernandez 14 bir yöntem geliştirdi. Hücre bağlı yapılandırma bileşik yama altında plazma zarı içine dahil ve yavaş yavaş elektriksel temas sitozol (Şekil 1B) ile oluşturma membran sorgulamaktı. Nistatin 15 ve Amfoterisin B 16gibi birkaç farklı antifungaller veya yüzey saponin beta-escin 17,18 gibi kullanılabilir. Bu bileşiklerin gözenekleri monovalent katyon ve Cl– difüzyon sitozol ve yama pipet arasında sitozolik düzeyini oluştururlar ve Ca2 + 15gibi daha büyük iyonları korunması sırasında izin vermek için yeterince büyük oluşturmak, 16.
Delikli yama kullanılarak meydan potansiyel yüksek serisi dirençtir. Seri direnç (Rs) ya da erişim direnç yama pipet yere göre kombine direniş bitti. Yama-kelepçe kayıtları sırasında Rs membran direnci ile paralel olacak (Rm). Rm ve Rs bir gerilim bölücü olarak paralel çalışma. İle yüksek Rs, gerilim hataları kayıtları veren Rs üzerine düşecek. Hata kaydedilen büyük akımları ile daha büyük olacak. Buna ek olarak, gerilim bölücü de böylece zamansal çözünürlük etkileyen bir alçak geçiren filtre oluşturma bağımlı sıklığıdır. (Bkz: ayrıntılı okumalar referans 19için) gerilim Na+ akımları geçişli gibi sonuç olarak, delikli yama her zaman daha büyük ve hızlı akıntılar kayıtları izin vermeyebilir. Ayrıca, Rs yama-kelepçe kayıtları, yeniden kaydedilen geçerli değişiklikleri önde gelen sırasında değişebilir. Bu nedenle, yanlış pozitif Rs ilaç uygulama sırasında değiştiği durumlarda oluşabilir.
Elektrofizyoloji dilimlenmiş doku üzerinde ilk beyin 20nöronlarda elektrofizyolojik özellikleri çalışmaya Andersen laboratuvar tarafından kullanılmıştır. Tekniği detaylı araştırmalar tek hücreleri hem de daha sağlam bir ortamda hücre-hücre iletişim ve hücre devreleri açtı. Hipofiz dilimleri yapmak için benzer bir teknik Guérineau ve ark. tarafından 1998 yılında tanıtıldı 21. ancak, değildi 2005’ten önce bu beyin hipofiz dilim hazırlık şekilde teleost 22çalışmalarda yama-kelepçe için kullanıldı. Bu çalışmada yazarlar da delikli yama-kelepçe kayıtları kullanımı bildirdi. Ancak, uzak, hipofiz hücreleri elektrofizyolojik araştırmalar çoğu memeliler ve diğer omurgalı teleost balık 1,2,22,23 de dahil olmak üzere, sadece bir avuç yapılmıştır . Teleosts içinde birincil Disosiye hücreleri 24,25,26,27,28,29tarihinde,30 neredeyse tüm çalışmaları yapıldı .
Bugünkü yazıda, sağlıklı beyin hipofiz dilimleri modeli balık medaka üzerinden hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol anahat. Yaklaşım birçok avantaj birincil Disosiye hücre kültürleri için karşılaştırıldığında temsil eder. İlk olarak, hücreleri ayrışmış olan hücre kültür koşulları ile karşılaştırıldığında göreceli olarak korunmuş bir ortamda kaydedilir. İkinci olarak, dilim hazırlıklar dolaylı yollar hücre-hücre iletişim 22tarafından hangi Disosiye hücre kültür koşullarda mümkün değildir aracılı çalışma izin. Ayrıca, biz nasıl yürütüleceği delikli bütün hücreli yama-klemp tekniği Amfoterisin B ile gözenek oluşturan Aracısı olarak kullanarak elde edilen doku dilimleri üzerinde elektrofizyolojik kayıtları göstermek.
Medaka Asya, öncelikle Japonya’da bulunan yerel bir küçük tatlı su balığı var. Fizyoloji, Embriyoloji ve genetik medaka, 100’den fazla yıl 31için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve birçok laboratuarlarında yaygın olarak kullanılan araştırma modeli. Bu kağıt için özellikle önem farklı morfolojik teleost balık hipotalamus-hipofiz kompleks organizasyondur: memeliler ve kuşlar hipotalamik nöronlar nöro-hipofiz bezi endokrin hücreleri düzenleyen hormonları yayın ise medyan Hazretleri, portal sisteme doğrudan sinir projeksiyon teleost balık 32hipofiz endokrin hücreleri üzerine hipotalamik nöronların vardır. Böylece, dikkatle yürütülen beyin hipofiz Dilimleme ‘s ile balık, iyi korunmuş bir beyin hipofiz ağ hipofiz hücreleri ve özellikle nasıl hipofiz hücreleri elektrofizyolojik özellikleri araştırmak bize izin verdiği önem onların uyarılabilirlik kontrol ve böylece Ca2 + homeostazı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektrofizyolojik kayıtlar yama-klemp tekniği beyin hipofiz dilimleri kullanarak dikkatli optimizasyonu gerektirir. Teleosts araştırmalarda özellikle canlı hücre yürütmek için iyi optimize edilmiş memeli sistemlere dayalı iletişim kuralları kullanarak yayınlar çoğunluğu ile sınırlı iletişim kurallarıdır. Bu bağlamda, olmak önemlidir gibi parametreleri çeşitli fizyolojik pH ve osmolalite aslında farkında değil sadece tür bağımlı ama de çok bağımlı olup söz konusu organizma karada ve…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Bayan LourdesCarreon G Tan medaka tesisin bakımı ona yardım için ve Anthony Peltier açıklayıcı rakamları için teşekkür ederim. Bu eser NMBU ve Araştırma Konseyi Norveç, grant numaraları 244461 (su ürünleri programı) ve 248828 (Digital hayat Norveç programı) tarafından finanse edildi.
Materials
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
| Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| metal molds | SAKURA | 4122 | |
| steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
| Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
| Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
| polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
| microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
| glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
| Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
| optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicator | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
| Sucrose | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-acid | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
Referenzen
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
- Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
- Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary – Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
- Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
- Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Neher, E., Baker, P. F. . Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. . Single Channel Recording. , 113-114 (1983).
- Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
- Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
- Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).
- Andersen, P. Brain slices – a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
- Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
- Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
- Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
- Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
- Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
- Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
- Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
- Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
- Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
- . pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
- . MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
- Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
- Schmidt-Nielsen, K. . Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).
- Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).
- Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
- Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
- Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
- Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
- Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).
