本条的目的是提供一个详细的描述的建议程序, 以评估在意识小鼠呼吸功能的双室 plethysmography。
由有意识的主体在机体内自发呼吸而产生的风量变化是在 plethysmography 的基础上进行的, 这种技术用于非侵入性评估人类和实验动物呼吸功能的某些特征。本文主要研究双室 plethysmography 在小动物中的应用。它提供了有关方法的背景信息, 以及一个详细的分步程序, 以无侵入的方式成功地评估有意识的、自发呼吸的动物的呼吸功能。该磷酸氢钙可用于监测多个动物的呼吸功能, 并确定在选择的时间段和重复方式的雾化物质诱导的变化。本文采用控制和过敏小鼠的实验方法, 论证了该技术的实用性, 解释了相关的结果参数, 并讨论了相关的优缺点。总的来说, 磷酸氢钙提供了有效的和理论上的声音读数, 可以信赖的评估的意识小动物的呼吸功能, 在基线和挑战后, 雾化物质。
越来越多的人使用小动物来建模人类呼吸系统疾病, 敦促发展技术来定量评估这些动物呼吸系统的功能。目前, 强迫振荡技术被认为是评估小动物呼吸力学的最精确方法1,2。然而, 正如分型不确定原理所指出的, 在测量精度方面得到的是与 noninvasiveness3的损失进行交易的。事实上, 在受高度控制的实验条件下, 需要进行麻醉、气管切开或口服插管, 以及机械通气, 这些测量都是获得的。一个远离现实生活的场景。
在实验要求禁止使用麻醉药或要求很少或不偏离动物的自然生理状态的情况下, 可以考虑双腔 plethysmography (DCP)。顾名思义, 磷酸氢钙的设置由两个连接的刚性腔组成, 它们建立在前腔内, 从其胸腔, 在后室中尽可能地隔离动物的头部 (或鼻子)。在安装过程中, 动物是有意识的, 在被抑制时会自发地呼吸。由于周围空气的压缩/减压, 分庭的墙壁不能扩张或收回, 在动物的空气进出的运动产生一个对应的, 但相反的波形在后方腔内。由于前腔内鼻腔流动而引起的波形与后腔内的胸部运动有关, 因此可以同时分离和捕获。根据 DCP 设置的设计, 这些波形可以通过一组压力传感器或 pneumotachographs 来获得, 以分别记录腔室压力的变化或腔内的气流, 作为时间的函数。后一种方法现在比较常见。
当动物的呼吸频率可以通过任何一种 plethysmography 技术精确地确定时, 在潮汐体积的测定和相关的通风参数 (例如, 分钟通风,呼气量等)。与全身 plethysmograph (人造板) 技术不同的是, 该动物的潮汐体积估计从箱信号4,5, DCP 技术提供了准确的潮汐量评估。这与动物在后室的胸部运动直接获得有关, 这与呼吸期间肺容积的变化成正比。
除了这些准确的通气参数 (如潮汐容积, 呼吸频率, 和分钟通风), 一些干扰的形状的呼吸循环也可以用来调查神经元方面, 控制呼吸驱动或呼吸反射。该应用的一个具体例子是评估吸入物质对上呼吸道感觉神经元的刺激电位6。在这里, 在失效开始时暂停的持续时间是使用称为端吸气停顿 (EIP) 的参数确定的, 也称为制动6的持续时间。这种暂停的刺激物质的延长是与动物的声门关闭有关, 导致一个可测量的制动周期的第一部分的失效6,7。
磷酸氢钙的另一个重要优点是, 它提供了两个验证和无争议的参数, 对气流阻塞敏感。一个被称为流在中潮汐呼气容积和缩写 EF508,9,10。它是气流在每个潮汐呼吸的中途容量在失效期间。EF50 从胸腔的流动轨迹中提取出来, 因此可以在没有前腔的情况下进行测量 (即在头部外的配置中)。另一种称为特定气道阻力和缩写 sRaw11,12,13。sRaw 的确定需要同时记录动物的鼻腔和胸腔的流动, 因为它是从这些单独的呼吸痕迹之间的时间延迟计算, 在零流点的灵感结束。阐述了这一拖延与 sRaw 有关的基础的理由, 以前11。简而言之, 肺容积的变化在空气运动之前, 因为压力梯度需要开发为了驾驶气流。在健康的动物安静地呼吸, 这种延迟通常是非常小的。然而, 适应给定流量所需的压力梯度 (例如, 足以提供足够通风的流量) 受气道阻力的影响。例如, 在支气管收缩过程中, 适应给定流量所需的压力梯度更大, 这意味着动物必须更加努力地呼吸。更大的压力梯度在动物的胸腔也意味着更大一部分的流动进出的后方室是由于减压/压缩空气内的胸腔, 这是部分的总胸部扩张/退缩, 这是与鼻腔流出相脱离。由于支气管收缩而增加的阻力会增加后方和前室之间的延迟, 从而增加 sRaw。驱动气流进出肺的压力梯度也受初始胸气容积 (TGV) 的影响。例如, 在更大的 TGV 上, 为了产生给定压力梯度所需的胸腔的扩张/缩进更大 (仅仅是因为产生给定压力梯度所需的体积位移更大), 这也意味着动物必须更努力地呼吸。再次, 这些额外的胸部置换是需要减压/压缩的空气在胸腔, 从而与鼻流的阶段。因此, 增加的 TGV 也会增加分庭之间的延迟, 从而增加 sRaw。正如可以看到的, 支气管收缩和增加的 TGV 会导致更重要的努力, 以吸引空气进出肺。这实质上是 sRaw 的生理意义。它代表呼吸5,14所需的工作。
因此, 重要的是要明白, 两个不同的因素影响 sRaw: 气道阻力和 TGV。事实上, sRaw 可以表示为气道阻力和 TGV11的产物。有意识的动物可以随时修改他们的 TGV, 以便使他们的通风适应特定的环境。在这种情况下, 动物的自然生理状态是不变的, 因此无法辨别 sRaw 的变化是否源于气道阻力的改变, 从 TGV 的变化, 或两者的混合。因此, 建议用更多侵入性测量呼吸力学和/或肺容积, 如1、15所提供的方法来补充 DCP 评价。
迄今为止, 该磷酸氢钙已用于各种研究应用。该技术可用于或没有头部室, 以定量和准确地评估各种物质, 如药物, 过敏原, 刺激剂或其他调解者的作用, 对意识小动物的呼吸功能16,17,18。前室还可用作曝气室, 以雾化物质或变化的气体浓度 (缺氧、高碳酸血症等)19。方便地, 它允许一个人伴随地测量这些暴露的急性影响。事实上, 磷酸氢钙的一个常见用途是评估在不同型号的呼吸道疾病中雾化乙酰甲胆碱的反应程度,20,21,22,23,24,25。
虽然 DCP 技术看似简单明了, 但一些实际的挑战可能会阻止没有经验的用户, 或损害结果的准确性和重现性。本文详细介绍了在有意识、克制、自发性呼吸小鼠中成功记录呼吸功能的推荐程序。说明是特定于所述设备 (请参阅材料表)。在基线和反应雾化乙酰甲胆碱的两株小鼠肺过敏性炎症的常见模型中也显示了磷酸氢钙的效用和价值。
在呼吸系统研究中, 显然有必要测量有意识动物的肺功能。一般来说, 磷酸氢钙是一个有趣的方法来评价呼吸系统的通气功能的自觉和自发呼吸动物26。更具体地说, 该磷酸氢钙或其头外变体往往在所提供信息的质量和所需的入侵3水平之间取得适当的平衡 (表 2)。该技术可以适应各种物种 (例如,老鼠, 鼠, 豚鼠) 或动物的大小, 可用于许多研究应用。它是特别有用的一次评估许多动物在一次平行的研究设计, 被重复的方式监测呼吸功能, 并且捕获反应的动力学在时间以后。此外, 该技术是直截了当的, 可以在比较及时的方式学习。本文以小鼠为例, 采用磷酸氢钙测定法, 对该约束 plethysmography 技术的实际操作进行了描述, 并讨论了关键步骤和相关结果。
在与有意识的动物一起工作时, 必须控制周围环境的条件 (例如,有数量有限的人或活动的安静的房间), 以便产生可重现的结果。由于抑制剂来自不同的维度, 所以从适当的尺寸开始是很重要的, 这样呼吸运动就不会受到干扰。这也是有益的, 往往需要适应动物的实验设置和程序, 因为它是很好的建立在小鼠, 抑制影响呼吸频率12。根据实验设计或条件, 可能需要多个会话的增量工期。最后, 允许动物实验开始时的时间调整到房间的变化和必要的处理是一个简单的考虑, 证明是有效的, 以确保呼吸模式是一贯定期和放宽基线。在动物舒适、适应性好、镇静的条件下工作, 在结果变异性和质量方面也会有好处。它也限制任何压力诱导的儿茶酚胺释放, 这可能增加气道口径和衰减诱导支气管收缩。
重要的是要明白, 有必要尽可能地分离鼻和胸流。根据所研究的系统或种类, 密封机制的形状和功效都不同。在我们所描述的磷酸氢钙中, 海豹是在动物的鼻子和抑制装置之间创建的。在用磷酸氢钙进行呼吸功能评估时, 还必须提供足够且连续的偏置流, 因为对动物可用氧气水平的降低会产生显著的影响。考虑到抑制剂动物的福祉, 限制了鼓动造成的空气泄漏的倾向, 从而使数据质量最大化。Contrastingly, 密封的断裂会导致被拒绝的数据集或某些参数的低估。
除了启用鼻腔流量信号的单独记录外, 头部腔通常用于使动物接触雾化物质。如本文所示, 这可以用来执行 bronchoprovocation 测试以显示不同程度的响应性。在这样的实验中, 根据所研究的动物的种类、应变或性别, 可能需要调整测试浓度的范围。如前所示的8,9,10,27, 目前的结果表明, 乙酰甲胆碱引起的 sRaw 的变化与侵袭性的气道阻力测量有很好的相关性。研究结果还表明, 磷酸氢钙技术并不像其检测呼吸功能障碍的能力那么敏感, 并确定在肺下部 (肺组织和/或小外围气道) 内局部改变的反应。.由于动物的气道完好无损, 上呼吸道的存在, 占到气流28的总呼吸阻力的最大部分, 可能会影响气溶胶的分布和沉积, 除了减弱的贡献下呼吸道的测量。表 3总结了磷酸氢钙法与该技术的其他区别。最后, 虽然理论上可以估计动物的总气道阻力 (包括上呼吸道) 从测量的 sRaw, 一般建议用一种侵入性测量技术来补充氢钙的评价, 如29获得对详细呼吸力学的直接测量。根据研究的目的, 对上呼吸道阻力的测量也可以被认为是30,31,32。
结论
由于其侵袭性有限, 磷酸氢钙是一种能满足呼吸研究的重要需求的技术。它能同时提供一些无可争议的气流阻塞指标, 准确地读数出意识动物的通气模式。获得的信息也真正补充了从更多侵入性的方法。
The authors have nothing to disclose.
SML 由加拿大卫生研究院的奖学金支持, MG 由 FRQS (全宗 de 研究所) 的呼吸道健康网络的助学金支持, YB 是 Santé的研究学者。
作者的贡献
所有作者贡献了原稿的构想和/或者录影。SML 和 LD 收集了这些数据。SML、LD、YB、DM、DB 和 AR 为数据分析、数字生成和手稿撰写做出了贡献。YB、AR、KL 和 MG 都参与了编写视频脚本的过程。这出戏是由 YB、KL 和 MG 表演的。
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |