Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado
Summary
O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.
Abstract
A finalidade desse método é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos colhidos não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Nós identificamos cinco etapas do fluxo de trabalho que são cruciais para a obtenção de RNA isolados de gânglios entéricos com qualidade e quantidade para RNA-Seq Em primeiro lugar, ao preparar o tecido intestinal, cada amostra deve ter excesso de líquido removido pela mancha antes de achatamento do serosa, tanto quanto possível através da parte inferior dos moldes base grandes. Amostras são então rapidamente congeladas em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane. Em segundo lugar, quando cortar o tecido, é importante para a posição cryomolds para que seções intestinais paralelo ao plano completo do Plexo mioentérico, produzindo, assim, a maior área de superfície dos gânglios entéricos por slide. Terceiro, durante a LCM, polietileno napthalate (caneta)-slides de membrana para oferecer a maior velocidade e flexibilidade para delinear as formas não-uniforme dos gânglios entéricos quando coletando gânglios entéricos. Em quarto lugar, para visualização distinta dos gânglios entéricos dentro de seções, etanol-compatível com corantes, como Violet cresilo, oferecem excelente preservação da integridade do RNA em relação a corantes aquosos. Finalmente, para a extração de RNA de gânglios capturados, observamos diferenças entre jogos comerciais da extração do RNA que rendeu superior quantidade de RNA e de qualidade, ao eliminar a contaminação de DNA. Otimização desses fatores no atual protocolo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras de gânglios entéricos com excepcional qualidade de RNA e quantidade.
Introduction
Este método foi projetado para obter amostras de RNA de alta qualidade dos gânglios entéricos do tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). O protocolo descrito aqui foi otimizado para fornecer qualidade de RNA e rendimentos suficientes para o RNA (RNA-seq) de sequenciamento e destina-se a ser usado com o recém-ressecados, não fixado, congelado tecido intestinal humano.
Transtornos da motilidade gastrointestinal e intestino funcional afetam um em cada quatro pessoas nos Estados Unidos. O sistema nervoso entérico (ENS), também conhecido como o segundo cérebro1, muitas vezes está no centro desses distúrbios, como desempenha um papel fundamental na homeostase de intestino e motilidade. Manipulação da motilidade do intestino tem sido geralmente restrita a ressecção cirúrgica do tecido agangliônico/noncontractile, modificação dietética crônica e/ou medicamentos. Surpreendentemente, a transcriptoma cheia de ENS o adulto permanece para ser sequenciado, limitando grandemente a nossa capacidade de identificar moléculas dentro do ENS que podem ser direcionados farmaceuticamente ou utilizados em terapias de células-tronco.
Há relativamente poucos métodos para isolar o RNA de gânglios entéricos humanos. A primeira abordagem, a dissociação de célula2, requer incubação alta temperaturas e tempos de incubação longo; ambos dos quais são conhecidos por promover a degradação de RNA e alterar o transcriptoma2,3. Uma abordagem alternativa, LCM, mais confiantemente preserva a transcriptoma e protege a integridade do RNA. Embora diversos estudos utilizaram LCM para coletar gânglios do tecido intestinal humano fresco congelado4,5,6, essas abordagens também foram prejudicados pela má qualidade do RNA e quantidade, foram bastante trabalhosas, ou necessária a modificação da coloração ou técnicas de extração de RNA para trabalhar nas nossas mãos. Outros protocolos de LCM projetados para a preservação do RNA que foram encontrados no produto LCM manuais fornecidos melhorias adicionais7,8, mas a adaptação foi necessária quando aplicado ao isolamento dos gânglios entéricos8, 9. por estas razões, nós desenvolvemos um protocolo otimizado com base nesses recursos que produz quantidades substanciais de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos humanos, tem um fluxo de trabalho relativamente rápido e produz resultados consistentes através de um grande número de amostras.
Neste estudo, apresentamos uma sinopse de procedimentos otimizados que facilitar o isolamento do RNA de alta integridade dos gânglios entéricos, originados de tecido intestinal humano ressecado. Nosso método incorpora cinco aspectos importantes. Primeiras, recém-ressecados, unfixed amostras intestinais humanas devem ser aparadas de tamanho, tem toda a umidade em excesso removido com um tecido de laboratório e achatada em um molde grande base antes do flash-congelamento em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane (2 MB). Em segundo lugar, histológicas seções do intestino devem estar preparadas para obter o plano completo do Plexo mioentérico em um slide, que oferece uma grande carga de gânglios entéricos. Sucesso com este passo é largamente dependente do processo de preparação do tecido. Em terceiro lugar, a estrutura não-uniforme de gânglios no ENS requer o uso de polietileno napthalate (caneta) membrana slides6, que oferecem a maior velocidade e precisão durante o processo de LCM. Quarta, etanol-compatível com tinturas, tais como cresilo violeta, devem ser usadas para preservar a integridade do RNA enquanto coloração gânglios entéricos. Por último, o processo de extração de RNA é fundamental para um bom resultado com RNA-Seq Buscamos uma abordagem de extração de RNA que produz alta integridade do RNA, maximiza o rendimento do RNA quando começando com pequenas coleções de gânglios entéricos, elimina a contaminação de DNA e mantém o maior número de espécies de RNA quanto possível.
Tomados em conjunto, otimização desses fatores no presente estudo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras dos gânglios entéricos com excepcional RNA de quantidade e qualidade. Os resultados foram amplamente consistentes entre um grupo considerável de amostras, indicando a consistência desta abordagem. Além disso, usamos essas abordagens para sequenciar com sucesso dezenas de amostras de RNA dos gânglios entéricos. As estratégias destacadas aqui também podem ser adaptadas em geral para a realização de LCM de gânglios desejados ou núcleos de periférico e sistema nervoso central e outros casos que requerem o isolamento do RNA de alta qualidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimento possibilita a coleta eficiente de inúmeros gânglios entéricos como uma fonte para derivar do RNA para RNA-Seq Aqui, nós temos acelerado os processos descritos nos protocolos existentes, maximamente, preservando a integridade do RNA. Como todas as etapas neste procedimento são interdependentes, é importante que todas as questões sejam eliminados desde o início do estudo e que todas as amostras são preparadas como da mesma forma um ao outro quanto possível, para obter confiança RNA-Seq
<p c…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos aos doadores e suas famílias que tornaram este trabalho possível. Agradecemos também a ajuda de funcionários do Instituto Internacional de medicina e Tennessee doador serviços para ajudar a coordenar a coleção de tecido utilizado neste estudo. Este trabalho foi apoiado por concessões do National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 para suporte a EMS2 e bolsa de NIH T32-DK007673 para AMZ. Estamos gratos ao pessoal da Vanderbilt translacional patologia recurso compartilhado para acesso ao instrumento de LCM e aconselhamento sobre a preparação do tecido. O recurso compartilhado de patologia tecido Vanderbilt é suportado em parte pelo NIH subvenções P30-CA068485-14 e U24-DK059637-13. Agradecemos o genoma tecnologia acesso centro, no departamento de genética na faculdade de medicina da Universidade de Washington para a ajuda com análise genômica. O GTAC parcialmente financiado pelo NCI câncer centro apoio Grant #P30 CA91842 ao centro Siteman de câncer e pelo TIC/CTSA Grant #UL1TR002345 do centro nacional para recursos de pesquisa (NCRR), um componente do National Institutes of Health (NIH) e do NIH Roteiro para pesquisa médica. Esta publicação é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa, necessariamente, a visão oficial da NCRR ou NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
Referenzen
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