Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige Möglichkeit zu isolieren und zu charakterisieren Maus primäre renale tubuläre Zellen, die anschließend südlich kultiviert werden können, um renale biologischen Funktionen ex Vivo, einschließlich der mitochondrialen Bioenergetik zu beurteilen.
Mitochondriale Dysfunktion in die renale tubulären Epithelzellen (TECs) führt zu Nierenversagen Fibrose, eine der Hauptursachen für chronische Niereninsuffizienz (CNI). Daher kann die Beurteilung der Funktion der Mitochondrien im primären TECs wertvolle Einblicke in den bioenergetischen Status der Zellen, die Einblicke in die Pathophysiologie der CKD vorsehen. Während für die Isolierung und Reinigung der proximalen Tubuli in verschiedenen Arten gibt es eine Reihe von komplexen Protokollen, fehlt das Feld eine kosteneffektive Methode für röhrenförmige Zellen isoliert ohne die Notwendigkeit der Reinigung optimiert. Hier bieten wir eine Isolation-Protokoll, die Studium mit Schwerpunkt auf beiden primären proximalen und distalen renal TECs Maus ermöglicht. Neben kostengünstigen Reagenzien und minimale Tier Verfahren, die in diesem Protokoll erforderlich können die isolierten Zellen halten hohen Energieniveaus nach Isolierung und Sub kultiviert bis zu vier Durchgängen, kontinuierliche Studien ermöglichen. Darüber hinaus bewerten mit einem hohen Durchsatz extrazelluläre Flussmittel Analyzer, wir die mitochondriale Atmung direkt in den isolierten TECs in eine 96-Well-Platte, für die wir Empfehlungen für die Optimierung der Zelldichte und compoundkonzentration versehen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass dieses Protokoll für renale tubuläre Ex Vivo -Studien mit einer konsistenten, gut standardisierte Produktion von renal TECs verwendet werden kann. Dieses Protokoll möglicherweise breitere zukünftige Anwendungen, mitochondriale Dysfunktion mit Nierenerkrankungen für Arzneimittelforschung oder Medikament Charakterisierung Zwecke zu studieren.
Renale tubuläre Epithelzelle (TEC) Funktion ist stark verbunden mit den allgemeinen Gesundheitszustand der Niere. Pathologische Signalgebung in der Niere bewirkt, dass die Entdifferenzierung von TECs, die spielt eine wichtige Rolle in der Niere Fibrose und chronische Niere-Krankheit (CKD)1,2. Als eine hochenergetische Organ ist die Niere nur noch von Herzen in Sauerstoffverbrauch, in erster Linie durch Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung3. Elektronenmikroskopie-Studien haben eine positive Korrelation von mitochondrialen morphologische Veränderungen auf pathologische Ereignisse in den Nierentubuli4gezeigt. Mitochondriale Dysfunktion bei TECs verursacht renal Fibrose durch epitheliale, Mesenchymale Transition5 und defekte Fettsäure-Oxidation6. Fibrose ist eine progressive Niereninsuffizienz Pathologie, die der CKD führt. Daher ist das Verständnis des energetischen Status der renalen TECs eine Notwendigkeit, die Pathophysiologie der CKD aufzudecken.
> 20 Zelltypen gibt es in den Erwachsenen Niere7. Um die Funktion der TECs zu studieren, braucht man eine Primärkultur der renalen epithelialen Zellen als Plattform für Molekularbiologie Anwendungen wie chemische Behandlungen und genetische Manipulationen. Wichtig ist, können genetische Manipulationen erfolgen in Vivo in Mäusen über Transgenese oder mit AAV gen Lieferung Techniken8 , so dass die isolierte primäre Zellen bereits genetisch manipuliert werden würde. Die Isolation der primären renal röhrenförmigen Zellen von Mäusen9,10, Ratten11,12,13, Eckzähne14, Kaninchen15,16und17 Menschen ,18 wurde berichtet mit Reinigungsschritte, reine proximale röhrenförmige Zellen ergeben. In diesen zuvor veröffentlichten Protokollen, die sich auf die Isolierung der proximalen röhrenförmigen Zellen, wurden für Reinigung Zwecke19Steigung Zentrifugierung und Sortierung Experimente durchgeführt. Während diese Protokolle für das Studium der proximalen Tubuli wertvoll sind, sind sie nicht ausreichend, wenn proximalen und distalen Tubuli erforderlich sind, untersucht werden. Zum Beispiel hat unsere Studie über das Alport-Syndrom ergeben, dass proximalen und distalen Nierentubuli spielen eine wichtige Rolle in der Krankheit Fortschreiten20, und beide Arten von den Nierentubuli in Kultur untersucht werden sollten. Eine aktuelle Studie über die renale Fluorid Toxizität zeigte auch, dass krankhafte Veränderungen in beiden der proximalen und distalen Tubuli21stattfand. Daher ist diese Isolierung Protokoll entworfen und optimiert für proximalen und distalen röhrenförmigen Zellen aus Maus Nieren mit minimalen Kosten von Reagenzien und einfache Verfahren. Alternativ können die Ermittler noch folgen das Protokoll erst Schritt 3.1 und Reinigung Schritte9 ab diesem Zeitpunkt für die Isolation der reinen proximalen röhrenförmigen Zellen hinzufügen.
Die isolierten Zellen hohe energetische Ebenen zu präsentieren und pflegen renalen epitheliale Eigenschaften nach der Sub-Kulturen auf 4 stellen. Mit einem hohen Durchsatz extrazelluläre Flussmittel Analyzer, bewerten wir die mitochondriale Atmung direkt in den isolierten TECs in einer 96-Well-Platte, die weitere Einblicke in die Zelle Dichte Optimierung führt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass dieses Protokoll auf renale tubuläre Ex Vivo -Studien mit einer konsistenten, gut standardisierte Produktion von renal TECs angewendet werden kann. Eine weitere Bedeutung dieses Protokolls ist seine machbar Verwendung als ein hoher Durchsatz-Tool für die ex-Vivo Charakterisierung der mitochondrialen Bioenergetik im proximalen und distalen röhrenförmigen Nierenzellen. Daher kann es als Plattform für Arzneimittelforschung oder Medikament Charakterisierung von Nierenerkrankungen dienen.
Wir ein Protokoll, das ermöglicht die effiziente Isolierung der Maus renale tubuläre Epithelzellen (TECs) optimiert und zeigten, dass die Zellen für eine extrazelluläre Flux-Analyse, bewerten die mitochondriale Atmung im Beisein von Fettsäure – Sub kultiviert werden können und/oder Glukose-basierte Substrate. Dieses Protokoll ist für Studien mit Schwerpunkt auf proximalen und distalen röhrenförmigen Zellen konzipiert und dient als Rahmen, um komplexere Experimente für das Verständnis der TEC Pathologie-assoziierten Nierenerkrankungen zu bauen. Im Vergleich zu früher veröffentlichten Protokolle9,10,19, diese Methode erfordert keine Steigung Trennungen mit langen Zentrifugation Zeiten oder eine ausreichend Antikörper-Nutzung für die Sortierung und bietet daher mehr effizienten und optimierten Leitfaden für Forscher im renale tubuläre metabolischen Bereich tätig. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll einschließlich der Verdauung, erneute Sammlung und Dichte Beschichtung und zusammengesetzte Optimierung für die extrazelluläre Flux-Assay.
Wahl der richtigen Art von Kollagenase und optimale Konzentration ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Verdauung und Dissoziation der röhrenförmigen Zellen von renal Gewebe. Im Vergleich zu anderen Arten von Collagenases, enthält Typ2 Kollagenase relativ höhere Ebenen der Protease-Aktivität, in der Lage, kompakte renale Strukturen aufzulösen. Um die Chancen einer Kontamination durch eine längere Durchblutung und Verdauung Zeit zu minimieren, wurde bei 30 mL/min 0,013 % Typ 2 Kollagenase durchblutet. Die renale Kapsel wurde nur entfernt, nachdem beide Nieren wurden vom Tier geerntet und in eine sterilisierte Zelle Kultur Kapuze übertragen. Die Nieren wurden in kleine Stücke gehackt und setzte ihre Inkubation mit 10 mL der Verdauung Puffer für weitere 5 Minuten für eine vollständige Verdauung und maximale Freisetzung von röhrenförmigen Zellen.
Obwohl nach der Verdauung, die Gewebe-Aufhängung durch einen 70-µm-Filter um sehr große Gewebe zu entfernen übergeben wird, wird noch sein unverdaute Tubuli, die durch den Filter passieren und bleiben innerhalb der Zellsuspension und bekommen auf der Kulturschale überzogen. Es dauert länger als normal für diese Tubuli röhrenförmige Zellen und der Kulturschale fest zuordnen. Daher ist es eher wichtig, sammeln die Zellsuspension und Zentrifugieren um ungebunden Tubuli und Zellen am zweiten Tag nach der Zelle Beschichtung pellet. Dieser langsame Zentrifugationsschritt weiter entfernt andere Zelltypen, die heller sind als röhrenförmigen Zellen und ermöglicht für ungebundene Tubuli und röhrenförmigen Zellen zu begleichen.
Die Identifizierung der richtigen Zelldichte ist der erste und wichtige Schritt für einen erfolgreichen extrazelluläre Flux-Assay. Die Ergebnisse zeigten, dass 40.000 Zellen pro Bohrloch auf einem XF96 Mikrotestplatte ist ideal für primäre röhrenförmigen Zellen in einer Fettsäure und einem Glukose-basierte Atmung-Assay (Abbildung 3). In diesem Protokoll wurden isolierte röhrenförmige Zellen für die extrazelluläre Flux-Assay an Stellen 1 und 2 verwendet. Die Zellen Sub kultiviert um 3, passage, obwohl sie einen Ausdruck der röhrenförmigen Marker (Abbildung 2) und eine ordentliche Leistung in der Bioenergetik-Assays (Abbildung 3A) gepflegt und verringerte Atmung basalen Ebenen im Vergleich zu Durchgang 2 zeigten (dargestellt durch den Vergleich von OCR in die am weitesten rechts liegenden Paneele der Abbildung 3A , Abbildung 3). Dieser Rückgang kann im wesentlichen gesunde röhrenförmige Zellen (z. B. solche, die von jungen Wildtyp Mäusen isoliert) nicht beeinträchtigen. Höheren Passagen der Zellen können jedoch für Studien an Zellen isoliert von CKD-Maus-Modellen, die bereits über eine verminderte mitochondriale Atmung, einen weiteren Rückgang der basalen Atmung führen, die Ergebnisse der extrazellulären Flux-Test beeinflussen würde. In die Studien durchgeführt, die Zellen von Abschnitt 1 und Abschnitt 2 zeigte hohe basale Atmung Ebenen. Daher wird empfohlen im Anschluss an dieses Protokoll mit diesen beiden frühen Passagen für mitochondriale Atmung Studien mit Zellen von gesunden und erkrankten Tieren isoliert. Zellen aus Abschnitt 2 sollte noch berücksichtigt werden, wenn die Durchgang 1 Subkultur nicht genügende Zellen für die Flux-Assay erbringt. Neben Bioenergetik Studium zeigt unserer bisherigen Forschung, dass primäre TECs in der Passage 3 äußerst nützlich für die Behandlungen mit Verbindungen gefolgt von Proteinen und RNA Studien (Daten nicht gezeigt). Abgesehen davon, empfehlen wir, dass Ermittler unter Verwendung dieses Protokolls, um röhrenförmige Zellen zu isolieren sorgfältig, die optimale Passage für verschiedene Anwendungen auswählen sollte.
Das Prinzip der extrazellulären Flussmittel Analyse basiert auf die Interaktionen zwischen den injizierten Substanzen und die Atmung Kette komplexe und die Wirkung der Entkuppler. Oligomycin ist ein Inhibitor der Komplex V (ATP-Synthase) und wird verwendet, um ATP-linked Sauerstoffverbrauch und den Sauerstoffverbrauch, der erforderlich ist, um das regelmäßige Proton Leck über eine innere Mitochondrien-Membran32überwinden zu unterscheiden. FCCP entkoppelt Sauerstoffverbrauch aus der ATP-Produktion durch die mitochondriale Membranpotential stören. So bietet es ein Maß für die maximale Atmung Kapazität, da es die begrenzte Kapazität der ein Proton Ionen-Efflux von ATP-Synthase umgeht, dadurch, dass einen PROTONENTRANSPORT durch die Membran. Antimycin A, ein Komplex III-Hemmer, und Rotenon, ein Komplex ich Blocker, werden in Kombination verwendet, um die gesamte mitochondriale Atmung ermöglicht einer Differenzierung zwischen mitochondrialen vs. nicht-mitochondriale Sauerstoffverbrauch in Herunterfahren die Zellen. Diese Verbindungen sollten immer titriert werden, für einen bestimmten Zelltyp vor der extrazellulären Flux-Test die optimalen Konzentrationen bestimmen, die die optimale OCR-Kurven ergeben. Hier empfehlen wir 1 µM Oligomycin, 1 µM FCCP und 2 µM Rotenon/Antimycin A zum extrazellulären Flux-Test auf primäre TECs.
Zusammenfassend, bietet dieses Protokoll eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, renale primäre proximale und distal tubuläre Epithelzellen zu isolieren, die für die Beurteilung der mitochondrialen Bioenergetik ex Vivoverwendet werden können. Während dieses Protokoll in eine Vielzahl von molekularbiologischen Studien erforschen die biologische Funktion der renale tubuläre Epithelzellen nützlich sein kann, erkennen wir seine Grenzen, wenn es auf Studien benötigen reine proximalen oder distalen Tubuli anwenden. Zum Beispiel Studien über die Lowe-Syndrom, eine selektive proximale tubuläre Dysfunktion33oder Studien auf distale renale tubuläre Azidose, eine distale tubuläre Dysfunktion34, müsste ein anspruchsvoller Protokoll für Zelle isoliert und Reinigung. Für die Mehrheit der Studien, die Tubuli vs. Glomeruli zu vergleichen und für Studien mögliche mitochondriale Atmung Regulierungsbehörden in röhrenförmigen Zellen im Allgemeinen auf den Bildschirm sieht das Protokoll einen machbaren Hochdurchsatz-Ansatz. Dieses Protokoll müssen daher breite Anwendungen, mitochondriale Dysfunktion mit Nierenerkrankungen Entdeckung oder Ziel Validierungszwecken Droge zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse an Lina A. Shehadeh unterstützt: das National Institute of Health (R56HL132209 und 1R01HL140468) und Miami Heart Research Institute.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |